出典:LaRiviere, W. B. et al., ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によるグリコサミノグリカンの検出。J. Vis. Exp.(2021年)
このビデオは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してマウス肺組織から分離されたヘパラン硫酸の分離手順を示しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
ポリアクリルアミドゲル電気泳動:マウス肺組織から単離された様々な鎖長のヘパラン硫酸を検出するための分析技術
3.5K 閲覧数
⸱
2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. 単離精製されたグリコサミノグリカンのポリアクリルアミドゲル電気泳動
- ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に必要な溶液をあらかじめ調製しておきましょう（表1）
手記： サンプル中に存在すると予想されるグリコサミノグリカンのサイズに応じて、分離ゲル溶液のアクリルアミドの割合を選択します。より大きなフラグメント(長さが30を超える二糖サブユニット)の分離には15%が推奨されます。22%:小さなフラグメント(長さ<20二糖サブユニット)の場合。 - 空のカセットをPAGEタンクに入れます。次のように分離ゲルをキャストします:15 mLチューブで、10 mLの分離ゲル溶液、60 μLの10%過硫酸アンモニウム(新たに調製する必要があります)、および10 μLのTEMED(最後にTEMEDを添加)を混合します。チューブを2〜3倍に静かに反転させます。ピペットを使用して、上記の10mL溶液をカセットにすばやく追加します。2 mLの脱イオンろ過水で重ね、分離ゲルを30分間重合させます。
手記： 以下のPAGEプロトコルは、厚さ13.3 x 8.7cm(幅×長さ)の1.0mmキャスティングカセット、総容量約12mLの垂直PAGEシステム用に最適化されています。他のカセットシステムも使用できますが、エンドユーザーによる最適化が必要な場合があります。 - 分離ゲルが完全に重合した後、重ね合わせた水を捨て、次のようにスタッキングゲルをキャストします:15 mLチューブで、3 mLのスタッキングゲル溶液、90 μLの10%過硫酸アンモニウム(新たに調製する必要があります)、3 μLのTEMED(最後にTEMEDを添加)を混合します。
- チューブを2〜3倍に静かに反転させます。ピペットを使用して、固化した分離ゲルの上にスタッキングゲル溶液をすばやく追加します。カセットを縁まで満たします。セットアップに含まれているコームを完全に挿入します。スタッキングゲルを30分間重合させます。
- ゲルが重合したら、テープストリップがカセットの底から剥がされていることを確認し、カセットをPAGEタンクアセンブリに戻します。
- 上部と下部のチャンバーにそれぞれ上部と下部のチャンバーバッファーを充填します。
- ステップ1.11.4の乾燥サンプルを、必要最小限の脱イオンろ過水(最大でPAGEゲル内のウェル容量の50%)に溶解します。サンプルローディングバッファーと1:1を混合します。サンプルとHSオリゴ糖の「はしご」(表1を参照)をゲルにロードします。
- ゲルを100Vで5分間予備分析します。次に、ゲルを200Vで20〜25分間(15%ポリアクリルアミド分離ゲルの場合)、40〜50分間(18%ポリアクリルアミド分離ゲルの場合)、90〜100分間(22%ポリアクリルアミド分離ゲルの場合)
手記：200 V のランタイムの最適化が必要な場合があります。フェノールレッドは、長さが2つのポリマーサブユニット(すなわち、重合度2、またはdp2)であるヘパリンオリゴ糖の前に移動します。ブロモフェノールブルーはDP10-DP14より先に移動します。最良の結果は、フェノールレッドバンドがゲルの底部にほぼ移動する(完全ではない)ように電圧を印加した場合に得られます。それに応じて実行時間を調整します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
>表1:精製グリコサミノグリカンのポリアクリルアミドゲル電気泳動に必要な溶液。すべての溶液は、使用前にろ過(0.22μm)する必要があります。
| >注:すべての溶液は、使用前にろ過(0.22μm)する必要があります。 | |||
| 解決 | レシピ | 組成 | コメント |
| 分離ゲル/下部チャンバーランニングバッファー(2 Lまたは4 L) | ホウ酸、MW 61.83 | 2L:1... | |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 過硫酸アンモニウム(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP179-25 | 電気泳動グレード |
| Barnstead GenPure Pro 純水製造システム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10-451-217PKG | 任意の水脱イオン/浄化システムは、許容される代替品です |
| ホウ酸(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A73-500 | 分子生物学グレード |
| ブロムフェノールブルー(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | B392-5 | |
| PAGE用Criterion空カセット(厚さ1.0mm、12+2ウェル) | バイオ・ラッド | 3459901 | 厚さ1.0mmのPAGEキャスティングカセットシステムであれば十分です |
| Criterion PAGE セルシステム(セル・電源) | バイオ・ラッド | 1656019 | 同等の垂直ゲルPAGEシステムが機能します) |
| EDTA二ナトリウム塩(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-002-786 | 分子生物学グレード |
| グリシン(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | G48-500 | 電気泳動グレード |
| 塩酸(液体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A466-250 | |
| N,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP171-25 | 電気泳動グレード |
| フェノールレッド(ソリッド) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | P74-10 | 遊離酸 |
| ショ糖(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP220-1 | 分子生物学グレード |
| テメド(N、N、N'、N'-テトラメチレンジアミン) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP150-20 | 電気泳動グレード |
| トリスベース(ソリッド) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP152-500 | 分子生物学グレード |
| 真空フィルターユニット、シングルユース、0.22uM ポアPES、500mL容量 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 〒569-0020 | 代替容量とフィルター材料は許容範囲 |
| アクリルアミド(固体) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP170-100 | 電気泳動グレード |
| ヘパリン由来デカサッカライド(dp10) | ガレン科学 | HO10 | |
| ヘパリン由来ヘキササッチャード(dp6) | ガレン科学 | ホ06 | |
| ヘパリン由来オリゴ糖(dp20) | ガレン科学 | HO20 |
タグ
