出典:Sultana, S. et al.タンパク質毒性ストレッサーによる大腸菌の治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化。J. Vis. Exp.(2021年)。
このビデオでは、タンパク質の変性ポリアクリルアミドベースの分離技術を示しています。この手法は、分子量に基づくタンパク質の予備的な同定に役立ちます。
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方法論記事
タンパク質分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動:分子量に基づいてタンパク質を分離し、可視化する技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
>1. SDS-PAGEを用いた抽出タンパク質凝集体の分離と可視化
- 12% SDS-ポリアクリルアミドゲルを調製します
- 2つの分離ゲルの場合、5.1 mLの二重蒸留水(ddH2O)、3.75 mLのTris-HCl(pH 8.8)、7.5 mLの20%(w / v)SDS、6 mLの30%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)溶液、75 mLの10%過硫酸アンモニウム、および10 mLのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を15 mLの遠心分離チューブにピペットで移し、気泡を導入せずに穏やかに混合します。ガラスプレート内に1mLピペットを使用してゲルを注ぎ、上部2cmに混合物が入らないようにします。分離ゲルの上に70%エタノールを加え、2つの層の間に均一な界面を確保します。
- 分離ゲルの重合後、1.535 mLのddH2O、625 mLのTris-HCl(pH 6.8)、12.5 mLの20%(w/v)SDS、335 mLの30%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)溶液、12.5 mLの10%w/v過硫酸アンモニウム、および2.5 mLのTEMEDをピペッティングして、スタッキングゲルを調製します。分離ゲルからエタノールを取り出し、スタッキングゲル溶液を加えます。気泡を入れずに、必要な数のポケットでコームを挿入します。重合を20〜30分間待ちます。
- 各サンプルとタンパク質ラダー4 μLを別々のウェルにロードし、トリスグリシンランニングバッファー(表1)中のゲルを144 V、室温で45分間泳>< 手記：ブロモフェノールバンドがゲルから移動しそうになったら、ゲルを停止します。
- 予熱したフェアバンクス溶液A(表1)でゲルをロッカーで30分間染色します。
- 予熱したフェアバンクス溶液D(表1)でゲルを、ロッカー上の所望の背景(一晩など)になるまで脱色します。
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結果
| ソリューション | レシピ |
| バッファ A | 10 mM リン酸カリウム (pH 6.5)、1 mM EDTA |
| バッファB | 2%のノニデットP-40を含むバッファーA。後で使用するために室温で保存できます。 |
| フェアバンクスA(染色液) | 25%イソプロパノール、10%氷酢酸、1.4 g Coomassie R-250 |
| フェアバンクスD(除染液) | 10%氷酢酸溶液 |
| 溶解バッファー | 10 mMリン酸カリウム(... |
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 化学薬品/試薬 | |||
| アセトン | フィッシャーサイエンティフィック | 67勝64敗1分 | |
| 30% アクリルアミド/ビサアクリルアミド溶液 29:1 | バイオ・ラッド | 1610156 | |
| 過硫酸アンモニウム | ミリポアシグマ | A3678-100Gの | |
| Bluestain 2 プロテインラダー、5-245 kDa | ゴールドバイオ | P008-500 | |
| β-メルカプトエタノール | ミリポアシグマ | M6250-100ミリリットル | |
| ブロモフェノールブルー | ゴールドバイオ | B-092-25 | |
| クーマシーブリリアントブルーR-250 | MPバイオメディカルズLLC | 821616 | |
| エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA) | シグマ・アルドリッチ | SLBT9686 | |
| 氷酢酸 | ミリポアシグマ | ARK2183-1L | |
| グリセロール、99% | シグマ・アルドリッチ | G5516-1L | |
| グリシン | ゴールドバイオ | G-630-1 | |
| イソプロパノール(2-プロパノール) | シグマ | 402893-2.5L | |
| 10x MOPSバッファ | テクノバ | M2101 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | シグマ・アルドリッチ | L3771-500G | |
| テトラメチルエチレンジアミン(TEMED) | ミリポアシグマ | T9281-50ミリリットル | |
| トリスベース | ゴールドバイオ | T-400-1 | |
| 材料・備品 | |||
| 電源 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | EC105 | |
| ロッカー | アルカリサイエンティフィック | RS7235 | |
| 小さなガラス板 | バイオ・ラッド | 1653311 | |
| スペーサープレート(1 mm) | バイオ・ラッド | 1653308 | |
| 分光 光度 計 | サーモサイエンティフィック | 3339053 | |
| 15 mL遠心チューブ用の卓上遠心分離機 | ベックマン・コールター | ||
| 縦型ゲル電気泳動チャンバー | バイオ・ラッド | 1658004 | |
| ボルテクサー | フィッシャーボルテックスジーニー2 | 12-812 | |
| サーモミキサー | ベンチマーク・サイエンティフィック | H5000-HC | |
| 10ウェルコーム | バイオ・ラッド | 1653359 |
