RNA分析のための変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動:蛍光標識されたリン酸化RNAオリゴヌクレオチドをそれらの非リン酸化同等物から分離する技術

要約

出典:Pillon, M. C., et al., Small Nucleotide Substratesのポリヌクレオチドリン酸化を測定するための非放射性アッセイ.J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、リン酸化RNA種を非リン酸化RNA種から分離するための変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実演します。RNA種は、ゲル上でレーザー検出するために蛍光標識されています。

プロトコル

1. ゲル電気泳動

1. 15% アクリルアミド/8 M 尿素ゲル溶液を調製します.
   注意：アクリルアミドは神経毒であるため、取り扱いには注意が必要です。取り扱うときは、常に手袋、白衣、ゴーグルを着用してください。
   1. 150 mLのガラスビーカーに、22.5 mLのプレミックス40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド29:1溶液、6 mLの10x TBE、28.8 gの尿素、およびRNaseフリー水を組み合わせて、合計容量59 mLにします。.溶液を静かに攪拌します.
      手記： RNA基質の長さによっては、ポリアクリルアミドの割合を変更すると、非リン酸化RNAとリン酸化RNAの間の分解能が向上する場合があります。
   2. 尿素を溶解するには、溶液を電子レンジで20秒間加熱し、液体を攪拌し、すぐに溶液をさらに20秒間電子レンジに戻します。
   3. 冷水が入った浅瀬の浴槽にガラスビーカーを入れて、溶液をゆっくりと冷却します。ガラスビーカーの周囲の冷水のレベルが、ガラスビーカー内の溶液のレベルを超えていることを確認してください。これにより、効率的な熱伝達が促進されます。5分待つ.
      手記：ガラスビーカーが暖かく感じる場合は、このプロトコルを続行しないでください。水は25°C未満である必要があります。5分経ってもまだ暖かく感じる場合は、ウォーターバスの水を新鮮な冷水に交換し、さらに5分待ちます。
   4. 0.22 μmの使い捨てろ過ユニットを使用して溶液をろ過および脱気し、微粒子や微細な気泡を除去します。
2. 変性ジェルを注ぎます
   1. 31.0 cm x 38.5 cmの全体寸法のゲル用に設計された短いガラスプレートと長いガラスプレートを洗浄するには、石鹸と温水を使用します。各ガラスプレートに95%エタノールをスプレーし、ガラスを拭いて水分を取り除きます。
      手記：2枚のプレートのうち1枚は、ガラスプレートサンドイッチを分離する際にゲルが損傷するのを防ぐために、シリコン処理することができます。ただし、このプロトコルはガラス板を分離せずにRNAを視覚化するように設計されているため、この手順は必要ありません。
   2. 長いガラス板を箱の上に水平に置き、ベンチトップから持ち上げます.
      注意：アクリルアミドは有毒であるため、ゲル注入ステーションは、こぼれた液体を吸収できるベンチペーパーで覆い、手順が完了したらすぐに廃棄物袋に入れる必要があります。
   3. 長いガラスプレートの長辺に沿ってきれいな0.4mmスペーサーを配置します。
   4. 長いガラス板の上に短いガラス板を置き、短いプレート、長いプレート、およびスペーサーの端が揃っていることを確認します。クランプ 3つの等間隔の金属クランプを使用して両側をクランプします。
   5. ステップ3.1で調製した15%アクリルアミド/8 M尿素溶液に24 μLのTEMEDを加え、溶液を混合します。
   6. ステップ1.2.5の溶液に600μLの10%(w / v)APSを加え、溶液を穏やかに混合します。
   7. すぐにガラス板の間に溶液を注ぎます.
      手記：気泡を避けるために、溶液が注がれているときにグラスを軽くたたきます。
   8. ガラスプレートサンドイッチの上部に、きれいな0.4 mm、32ウェルコームを慎重に追加します。
   9. アクリルアミドが重合するまで、最低30分待ちます。
3. 変性ゲルを走らせる
   1. ヒートブロックを75°Cに設定します。
   2. 金属clを取り外しますamp ガラスプレートサンドイッチを固定し、ガラスプレートサンドイッチを完全に洗って乾かします。
   3. ガラスプレートサンドイッチを短いプレートを内側に向けてゲル装置に入れます。
   4. 100 mLの10x TBEと1.9 L RNaseフリー水を組み合わせて、0.5x TBEランニングバッファーを調製します。600 mLのランニングバッファーをゲル装置の上部および下部のチャンバーに加えます。
   5. コームをそっと取り外し、注射器を使用してウェルを十分にすすいでください。注:このステップは、ウェルから尿素を除去するために重要です。
   6. 電圧は約2,000Vです50Wで30分間ゲルを事前に実行します注意:このゲル装置は高ワット数で動作し、ユーザーは注意を示す必要があります。
   7. シリンジを使用してウェルをよくすすぎます.
      手記：このステップは、サンプルをウェルに均一にロードするために重要です。
   8. パルスは、消光反応を回転させます。次に、チューブを75°Cで3分間インキュベートします。パルススピンを繰り返します。
   9. すぐにウェルあたり10 μLのサンプルをロードし、ゲルを50 W.
      で3時間泳動します 手記： 蛍光標識されたRNAは光感受性です。したがって、ゲル装置をホイルで覆います。
4. 変性ゲルをイメージしてください。
   1. 電源を切り、ゲル装置の上部チャンバーを排水します。
   2. グラスプレートサンドイッチの外側を石鹸と水で洗い乾かします。ゲルを輸送しながら、ガラスプレートサンドイッチをホイルで覆います。
   3. ガラスプレートサンドイッチを、定量的で高感度な蛍光検出が可能なレーザースキャナーのステージに取り付けます.
      手記：このゲルは、最大分解能を実現するために非常に薄いです。このため、このプロトコルは、蛍光標識されたRNAをガラスプレートを通して直接可視化することにより、ガラスプレートサンドイッチからゲルを除去する困難を回避するように設計されています。市販の低蛍光ガラスプレートを使用すると、S/N比が向上し、捕捉されるシグナルが増加します。
   4. レーザースキャナーの励起波長と発光波長を目的の蛍光色素に設定します.
      手記：最適な励起波長と蛍光波長は、特定の蛍光色素によって異なる場合があります。FAM蛍光色素の場合、励起波長は495 nm、蛍光波長は535 nmです。
   5. レーザースキャナーステージで視覚化する領域を定義し、製造元の指示に従ってゲルを画像化します(図1)。

結果

図1: リン酸化RNAの変性ゲル分析の例。 Las1-Grc3 (110 nM) の in vitro RNA キナーゼアッセイと 500 nM の SC-ITS2 RNA をインキュベート。XはLas1-Grc3を使用しない制御反応を示し、黒い三角形は0-10 mMのATPの滴定を表します。C2 RNAは、Las1ヌクレアーゼによるSC-ITS2 RNAの切断の結果であり、Grc3 PNK活性の内因性基質です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.4 mm 34ウェルコーム	バイオラッド	1653848
0.4mmスペーサー	バイオラッド	1653812
0.5 M EDTA ph 8.0	KDメディカル	RGF-3130
1M塩化マグネシウム	KDメディカル	CAC-5290
1MトリスpH 8.0	KDメディカル	RGF-3360
40% アクリルアミド/ビス溶液 29:1	バイオラッド	1610146
5M塩化ナトリウム	KDメディカル	RGF-3720
過硫酸アンモニウム(APS)	バイオラッド	〒161-0700
ATPの	シグマ	A2383-1Gの
ホウ酸	シグマ	B0394
ブロモフェノールブルーナトリウム塩	シグマ	B5525-5Gの
ガラスプレート	トーマス・サイエンティフィック	1188K51
Hoefer SQ3 シーケンサー	ヘファー	該当なし
イメージJソフトウェア	該当なし	該当なし	https://imagej.nih.gov/ij/
標識RNAオリゴヌクレオチド	IDTの	カスタムオーダー
Pharmacia EPS 3500電源	ファルマシア	該当なし
Steriflip 0. 22 umフィルター	ミリポア	5FCP00525
テメド	バイオラッド	〒161-0800
トリスベース	シグマ	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 ゲルイメージャー	GEヘルスケア	該当なし
超高純度DEPCウォーター	インビトゲン	750023
超高純度グリセロール	インビトゲン	19E1056865
尿素	フィッシャーケミカル	U15-500

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