出典:Hanna-Addams, S., et al. アミロイドまたはアミロイド様繊維のサイズ不均一性を確認するための二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動の使用。J. Vis. Exp.(2018年)。
このビデオは、アミロイド繊維の二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動ベースの分離を示しています。この手法では、多型アミロイド凝集体をその不均一なサイズに基づいて分離します。
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方法論記事
二次元半変性アガロースゲル電気泳動:サイズ不均一性に基づく多形アミロイド繊維を分離する技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. サンプルの準備
- 10 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10 mLの10 mLの10 cm組織培養皿でHT-29アミロイド産生HT-29結腸癌細胞を培養します。 細胞を37°Cのインキュベーターで一晩、5%CO2で培養します。
- 細胞が80%のコンフルエント度に成長したら、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。3 mLのトリプシン溶液を加え、37°Cで3分間インキュベートします。
- 細胞が皿から完全に解離した後、10 mLの培地を加え、10 mLピペットで細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を1,000 x gで室温で3分間遠心分離します。培地を吸引し、細胞を5 mLの培養培地に再懸濁し、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。2 x 1010 10 cm皿2個にそれぞれ6個の細胞をプレートします。
- 細胞を接着させ、5% CO2を含む37°Cインキュベーターで一晩回復させます。20 ng/mL Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α)、100 nM Smac-mimetic、および 20 μM Pan-Caspase inhibitor Z-VAD-FMK を使用して、1 つのディッシュに処理を適....
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結果
図 1.実験的なプロトコル。(A)二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動(2D SDD-AGE)の模式図。まず、赤でラベル付けされた右端のレーンにサンプルをロードします。最初の寸法実行の終了後、ゲルを反時計回りに90°回転させます。2次元電気泳動を実行します。実線の矢印は 1 番目の寸法の方向を示し、点線の矢印は 2 番目の寸法の方向を示します。(B)毛細管現象による転写の模式図
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ゲル電気泳動ユニット | 漁夫 | HE99XPRO | ゲルランニングのためのappratus。 |
| アグロース | VWRの | 97062-250 | アガロースゲル用。 |
| DMEM | シグマ | D6429 | 細胞培養用 |
| ウシ胎児血清 | シグマ | F4135 | 細胞培養用 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | シグマ | P4333 | 細胞培養用 |
| トリプシン溶液 | シグマ | T4049 | 細胞培養用 |
| 組織培養用PBS | シグマ | D8662 | 細胞培養用 |
| 組換えTNF | 私たちの研究室で作られています | ネクロプトーシスを誘導するため。参考文献11を参照してください。 | |
| smac-模倣 | Xiaodong Wang博士からの贈り物 | ネクロプトーシスを誘導するため。参考文献11を参照してください。 | |
| ZVAD-FMKの | エイペックスバイオ | A1902(英語版) | ネクロプトーシスを誘導するため。参考文献11を参照してください。 |
| セルカウンター | バイオ・ラッド | 1450102 | TC20型 細胞計数用 |
| Pierce™ BCAタンパク質アッセイキット | サーモサイエンティフィック | 23225 | 細胞溶解物中のタンパク質濃度の測定 |
| セルリフター | 漁夫 | 07-200-364 | 皿から細胞を取り除くには |
| 溶解バッファー(1L) | 20 mL 1 M トリス pH 7.4 10 mL グリセロール 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (必要に応じてプロテアーゼおよびリン酸塩阻害剤) | ||
| 10X TAE(1 L) | 48.4 g トリスベース 11.42 mL 氷酢酸 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20から1 L | ||
| 4X SDD-AGEローディングバッファー(50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL グリセロール 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% ブロモフェノール Blue 31 mL の ddH2O | ||
| PBSTウォッシュバッファー(1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL トゥイーン20 | ||
| 10倍速PBS(10リットル) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4・2H2O 24 g KH2PO4 ddH2Oを10 Lに加え |
