二次元半変性アガロースゲル電気泳動:サイズ不均一性に基づく多形アミロイド繊維を分離する技術

要約

出典:Hanna-Addams, S., et al. アミロイドまたはアミロイド様繊維のサイズ不均一性を確認するための二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動の使用。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、アミロイド繊維の二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動ベースの分離を示しています。この手法では、多型アミロイド凝集体をその不均一なサイズに基づいて分離します。

プロトコル

1. サンプルの準備

1. 10 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10 mLの10 mLの10 cm組織培養皿でHT-29アミロイド産生HT-29結腸癌細胞を培養します。 細胞を37°Cのインキュベーターで一晩、5%_CO2で培養します。
   1. 細胞が80%のコンフルエント度に成長したら、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。3 mLのトリプシン溶液を加え、37°Cで3分間インキュベートします。
   2. 細胞が皿から完全に解離した後、10 mLの培地を加え、10 mLピペットで細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を1,000 x gで室温で3分間遠心分離します。培地を吸引し、細胞を5 mLの培養培地に再懸濁し、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。2 x 10^{10 10} cm皿2個にそれぞれ6個の細胞をプレートします。
   3. 細胞を接着させ、5% CO₂を含む37°Cインキュベーターで一晩回復させます。20 ng/mL Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α)、100 nM Smac-mimetic、および 20 μM Pan-Caspase inhibitor Z-VAD-FMK を使用して、1 つのディッシュに処理を適用してアミロイドの形成を誘導します。この組み合わせは TSZ と略されます。他の皿を車両をコントロールとして扱います。
2. 適切な時間(通常は6時間)後、細胞ライセートを回収します。
   1. プラスチック製のスクレーパーでプレートから細胞をこすり落とし、10 mLピペットを使用して15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を1,000 x gで4°Cで3分間遠心分離します。
   2. 10 mLの氷冷PBSに再懸濁し、1,000 x gで4°Cで3分間遠心分離することにより、細胞を2回洗浄します。PBS溶液を吸引します
      手記：このプロセスは、細胞ペレットを液体窒素で凍結し、80°Cで最大1か月間保存することで、ここで一時停止できます。
   3. 細胞ペレットを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、0.3 mLの溶解バッファーで氷上で30分間インキュベートします。20,000 x gで4°Cで15分間遠心分離します。上清は全細胞溶解物です.
      手記：このプロセスは、サンプルを-20°Cで最大数か月間保存することで、ここで一時停止できます。
   4. Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を測定します。4x SDD-AGEローディングバッファーを添加して、3 μg/μLのサンプル20 μLを調製し、室温で10分間インキュベートします。

2. ゲルの準備と実行

1. ガラスビーカーに入れた1x Tris-acetate buffer(TAE)200 mLにアガロース2 gを加え、電子レンジで加熱してアガロースを溶かします。1 mL の 20% SDS を添加して、最終濃度を 0.1% SDS にします。慎重に渦巻いて混ぜます。SDS追加後に気泡が発生しないように注意してください。
2. アガロース溶液を15 cm x 14 cmのゲルスラブに注ぎます。1mLピペットを使用して、気泡を取り除きます。上部に20ウェルコームを1つ置きます。
3. 1次元目:右端のレーンに60μgの全細胞ライセートをピペットで移します。0.1% SDSを含むTAEをランニングバッファーとして使用して、ゲルを60 Vで約4時間(色素のフロントがゲルを通して約3/4になるまで)分析します。
4. 2次元目:ゲルを反時計回りに90°慎重に回転させます(図1A)。ゲルを60Vで約4時間
   手記：一般的な走行条件は、ゲル長4V/cmです。1次元と2次元の実行条件がまったく同じであることが重要です。

結果

図 1.実験的なプロトコル。(A)二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動(2D SDD-AGE)の模式図。まず、赤でラベル付けされた右端のレーンにサンプルをロードします。最初の寸法実行の終了後、ゲルを反時計回りに90°回転させます。2次元電気泳動を実行します。実線の矢印は 1 番目の寸法の方向を示し、点線の矢印は 2 番目の寸法の方向を示します。(B)毛細管現象による転写の模式図

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゲル電気泳動ユニット	漁夫	HE99XPRO	ゲルランニングのためのappratus。
アグロース	VWRの	97062-250	アガロースゲル用。
DMEM	シグマ	D6429	細胞培養用
ウシ胎児血清	シグマ	F4135	細胞培養用
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ	P4333	細胞培養用
トリプシン溶液	シグマ	T4049	細胞培養用
組織培養用PBS	シグマ	D8662	細胞培養用
組換えTNF	私たちの研究室で作られています		ネクロプトーシスを誘導するため。参考文献11を参照してください。
smac-模倣	Xiaodong Wang博士からの贈り物		ネクロプトーシスを誘導するため。参考文献11を参照してください。
ZVAD-FMKの	エイペックスバイオ	A1902(英語版)	ネクロプトーシスを誘導するため。参考文献11を参照してください。
セルカウンター	バイオ・ラッド	1450102	TC20型 細胞計数用
Pierce™ BCAタンパク質アッセイキット	サーモサイエンティフィック	23225	細胞溶解物中のタンパク質濃度の測定
セルリフター	漁夫	07-200-364	皿から細胞を取り除くには
溶解バッファー(1L)			20 mL 1 M トリス pH 7.4 10 mL グリセロール 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (必要に応じてプロテアーゼおよびリン酸塩阻害剤)
10X TAE(1 L)			48.4 g トリスベース 11.42 mL 氷酢酸 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20から1 L
4X SDD-AGEローディングバッファー(50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL グリセロール 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% ブロモフェノール Blue 31 mL の ddH2O
PBSTウォッシュバッファー(1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL トゥイーン20
10倍速PBS(10リットル)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4・2H2O 24 g KH2PO4 ddH2Oを10 Lに加え

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