ネイティブタンパク質複合体を分離するためのMultimer-PAGE:青色のネイティブPAGEとSDS-PAGEからなるハイブリッド分離技術により、組織ライセートからインタクトな多量体タンパク質を分離します

Abstract

出典:Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolution Protein Complexes in Biological Samples.J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、組織ホモジネートからネイティブタンパク質複合体を分離するための多量体PAGEについて説明します。この手法は、青色のネイティブPAGE技術とSDS-PAGE技術のハイブリッドです。分離された複合体は、細胞機能におけるそれらの役割について特徴付け、研究することができます。

Protocol

1. 組織の準備

1. 4x BN-PAGEサンプルバッファー(200 mM Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methane (Bis-Tris)、200 mM NaCl、40% w/v glycerol、0.004% Ponceau S、pH 7.2).
   10 mLを調製します。 手記：このストック溶液は、事前に調製して4°Cで保存することができます。
2. 250 μL の 4x サンプルバッファーを 1x 市販プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む 750 μL dH₂O で希釈します。渦を巻いて氷の上で冷やします。
3. 1 mL 1x 氷冷BN-PAGEサンプルバッファー中の20 mgの標的組織を、クリーンダウンスホモジナイザーで30ストロークホモジナイザーでホモジナイズします
   手記：今回の実証実験では、ラットの脳組織全体を対象とします。均質化後、サンプルを2%ジギトニンなどの中性界面活性剤で処理して、膜タンパク質を可溶化し、電気泳動することができます。
4. ホモジネートを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、14,000 x gで30分間遠心分離して、不溶性の細胞内容物をペレット化します。遠心分離後、上清を氷上のきれいなチューブにデカントします。
5. 製造元の指示に従って、ビシンコニン酸(BCA)または類似のタンパク質定量アッセイを使用して上清タンパク質濃度を測定してください。
6. ホモジネートサンプルに界面活性剤が含まれている場合は、ホモジネート溶液が0.25%クーマシーになるまで十分な水溶液に5%クーマシーブルーG-250を添加します。

2. BNページ

1. 25 mLの20x Blue Native(BN)電気泳動バッファーストック(1.0 M Bis-Tris、1.0 Mトリシン、pH 6.8)を0.002% Coomassie Blueを含む475 mL dH₂Oに希釈して、500 mLの1xランニングバッファーを調製します。
   1. サンプルに界面活性剤が含まれている場合は、代わりに0.02%のクマシーを含む1xランニングバッファーを250 mL、さらに250 mLには含まない液体を1回
   流します。
2. バッファーを4°Cに冷却します。
3. ポリアクリルアミドゲルを注ぐカセットをメーカーの指示に従って洗浄して組み立てます。
4. 標準的なレシピに従ってBNポリアクリルアミドゲル(3%Tスタッキング層、6%T分離層)を注ぎ、ウェルコームを置きます。
5. ゲルが重合した後、カセットをdH₂Oですすぎ、メーカーの指示に従って電気泳動装置を組み立てます。
6. ウェルコームを取り外し、ウェルに1x BN-PAGEランニングバッファーを充填します。サンプルがロードされるまで、内部チャンバー全体をバッファーで満たすことは避けてください。
   1. サンプルに界面活性剤が含まれている場合は、0.02% Coomassie Blue.
      を含むバッファーをウェルに充填します。 注意: 手順2.7〜2.9を4°Cで実行します。
7. ゲルローディングチップを使用して、20 μgのタンパク質を含むホモジネートの量を目的のウェルにピペットで移します。等量の1x BN-PAGEサンプルバッファーを未使用のウェルにピペットで移します
   手記：BCAアッセイから決定されたタンパク質濃度を使用して、ウェルに添加するホモジネートの適切な容量を計算します。
8. サンプルをロードした後、インナーチャンバーに1x BN-PAGEランニングバッファーを充填します。ゲルがバッファーに完全に浸されていることを確認してください。次に、外側のチャンバーに1xランニングバッファーをメーカーが指定したレベルまで満たします。
   1. サンプルに界面活性剤が含まれている場合は、内側のチャンバーに0.02%のCoomassie Blueを含む1xバッファーを充填し、外側のチャンバーに色素フリーの1xランニングバッファーを充填します。
9. 電極を電源に接続し、ゲル中のタンパク質を150 Vで電気泳動し、色素バンドが分離層に~2 cm進行するまで行います。電源を停止して切断します。

3. クロスリンク

注:手順3.1〜3.6を4°Cで実行します。

1. 電気泳動装置を分解し、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキングレイヤーを取り外して廃棄します。
2. 染料前面の下端のすぐ下にゲルを慎重にカットします。できるだけ滑らかでまっすぐにカットするように注意し、未使用のジェル片を捨ててください。これにより、幅~2cmのポリアクリルアミドゲルの水平ストリップが残り、ホモジネートサンプル中のすべてのタンパク質が含まれます。
3. ジェルストリップの端に沿って未使用の部分を切り取ります。
4. ストリップを小さな容器に入った10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に慎重に入れ、ナットで30分間穏やかに混合して平衡化します。
5. 平衡化後、PBSを廃棄し、別の10mLと交換します。ジメチルスルホキシドに溶解した25 mM DSPを500 μLでPBSにピペットで移動し、上記のように混合を続けます(ステップ3.4)。
6. DSP溶液を注ぎます。2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.375 Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)(pH 8.8)を10 mL加えて、未反応のDSPをクエンチします。15分間章動を続けます。

4. SDSページ

1. ゲルストリップが急冷している間に、標準的な方法に従ってSDS-PAGEゲル溶液を調製します。重合試薬は添加しないでください。
2. 急冷後、ΒΝゲルストリップを室温に戻し、ストリップを新しいゲルカセットにキャストします。
   1. これを行うには、ゲルを慎重に手に取り、清潔なゲルカセットスペーサープレートに置きます。
   2. 染料の前面の下部が新しいカセットの上部に最も近いようにストリップの向きを設定します(つまり、BN-PAGE中に最も遠くに移動した側が新しいカセットの上部に最も近い必要があります。ゲルストリップは以前の向きから反転する必要があります)。図 1 を参照してください。
   3. ストリップの上端がカバープレートの上端と同じになるように(つまり、新しいゲルの上部に来るように)ストリップを配置します。染料の前面がガラスプレートの水平端と平行であることを確認してください。
   4. 切除したストリップの片側をスペーサー壁の1つに押し付け、反対側にゲルを注ぎ、タンパク質標準またははしごをロードするためのスペースを確保します。
   5. ジェルストリップの下端にギザギザや凹凸がある場合は、慎重に切り取ります。存在する場合、ゲルを注ぐときに気泡を閉じ込めます。
   6. ゲルストリップが正しく配置されたら、カバープレートをスペーサープレートの上に置きます。やさしく圧力をかけて、閉じ込められた気泡を押し出します。
   7. メーカーの指示に従って、ゲル注入装置の組み立てを続けます。.
3. 分離ゲルバッファーに重合試薬を添加し、血清学的ピペットを使用して調製したゲルカセットに注ぎます。ゲルカセットを切除したBN-PAGEゲルストリップの下~2cmまで充填し、スタッキング層のためのスペースを確保します。
4. 注いだゲルの上に100μLのブタノールを加え、分離層の重合に30分間待ちます。ブタノールを注ぎます。
5. 重合試薬をスタッキングゲル溶液に添加します。血清ピペットを使用して、スタッキング層を注ぎ、ゲルカセットに残っているすべての空きスペースを埋めます。
   1. スタッキング層を注ぐときにゲルカセットを傾けて、ゲルストリップの下のスペースを満たし、気泡が閉じ込められないようにします。
   2. スタッキングゲルバッファーがゲルストリップの下の空きスペースを埋めたら、ゲルカセットを徐々に水平な足場に戻します。
   3. 切除したゲルストリップの隣の空きスペースをスタッキングゲルバッファーで埋め続けます。
6. スタッキング層を30分間重合させます.
   手記：ゲルが重合している間に、10x SDS-PAGEランニングバッファー(250 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane (tris)、1.9 Mグリシン、1% SDS)を作製します。これは事前に作成して、室温で保存することもできます。
7. 50 mL 10x SDS-PAGEランニングバッファーストックを450 mL dH₂Oに希釈して、1xワーキングバッファーを調製します。
8. スタッキング層が重合した後、注入装置からゲルカセットを取り出し、dH₂Oですすぎ、メーカーの指示に従って電気泳動装置を組み立てます。
9. インナーチャンバーに1x SDS-PAGEランニングバッファーを完全に充填し、アウターチャンバーをメーカーが指定したレベルまで充填します。
10. 切除したゲルストリップの隣のスペースに、分子量ラダーまたは適切なタンパク質標準液をロードします。
11. 電極を電源に取り付け、サンプルを120Vで電気泳動します。Coomassie色素がゲルから流れ出したら、停止して電源を切断します。
12. エレクトロブロッティングの標準的な方法および抗体結合によるタンパク質検出を使用してゲルを分析します。

Results

図1:一般的なマルチマーPAGEフローチャート。
(A)BN-PAGEサンプルバッファーでのホモジナイズなどの非変性法を使用して組織ライセートを調製します。(B)ライセートをBN-PAGEゲルにピペットで移し、BN-PAGEランニングバッファーで電気泳動(150V)を行います。色素の前面が分離ゲルに~2 cm移動するまで、サンプルを移動させます。(C)重なり層と解像層の未使用部分を削除します。(D)(E) PBSを...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-アミノカプロン酸	シグマ	A2504
アクリルアミド	アクロス・オーガニックス	164855000	有毒です。
アクリルアミド/ビサクリラミド 37.5:1 (40%Tストック溶液)	BioRad	〒161-0148	毒性。
過硫酸アンモニウム	シグマ	A3678
ヤギ由来抗ウサギIgG-HRP	サンタクルスバイオテクノロジー	sc-2004
ビシンコニン酸アッセイキット	サーモフィッシャー	23225
ビストリス	シグマ	B9754
ウシ血清アルブミン	シグマ	A9647
ブタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A399-1
化学発光基板キット	サーモフィッシャー	24078
クーマシーブルーG-250	シグマ・アルドリッチ	B0770
デジトニン	シグマ	D141	毒性。
ジメチルスルホキシド	フィッシャーサイエンティフィック	D128-1
ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)	Thermo Scientific	22585
乾燥脱脂乳	ラボサイエンティフィック	M0841
グリセロール	シグマ	G9012
グリシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP381-5
HALTプロテアーゼ阻害剤カクテル	サーモフィッシャー	78430
酸	フィッシャーサイエンティフィック	A144SI-212	滴定用。苛性。
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A412-4	PVDF膜の活性化用。毒性。
モノクローナル抗&α;-シヌクレインIgG(ウサギSanta	Cruz Biotechnology由来)	sc-7011-R
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン	シグマ	T9281
N,N'-メチレンビスアクリルアミド	アクロス・オーガニックス	16479	有毒。
NP40	ボストン・バイオプロダクツ	P-872
ポリソルベート 20 (tween-20)	フィッシャーサイエンティフィック	BP337-500
ポリフッ化ビニリデン転写膜	Thermo Scientific	88518
ポンソー S	シグマ	P3504
カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	P217-3
カリウム一塩基性	シグマ	P9791
プロテアーゼ阻害剤カクテル	サーモサイエンティフィック	88265
SDSソリューション(10%w / v)	バイオラッド	161-0416
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP358-212
ドデシル硫酸ナトリウム	シグマ	L37771
リン酸ナトリウム一塩基性	フィッシャーサイエンティフィック	BP329-1
トリシン	シグマ	T0377
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M バッファー、pH 6.8)	バイオラッド	161-0799
Tris-HCl(1.5 M緩衝液、pH 8.8)	バイオラッド	161-0798
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GEヘルスケア	28-9558-10
ImageJソフトウェア NIH
Synergy H1マイクロプレートリーダー	BioTek
ゲルフォーマー + スタンド	Biorad
Microfuge 22R 遠心分離機	ベックマン・コールター
2 mL ダウンス ホモジナイザー
ボルテックスミキサー	フィッシャーサイエンティフィック
超音波組織ホモジナイザー	フィッシャーサイエンティフィック