PCR後のDNAアンプリコンのアガロースゲル電気泳動:マルチプレックスPCRの産物を分析し、PCR反応の成功を評価する方法

要約

出典:Gulla, S. et al.マルチローカス マルチプレックスPCRおよびキャピラリー電気泳動による魚病原性細菌Yersinia ruckeriの可変数タンデムリピート解析。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、アガロースゲル電気泳動を使用して細菌のPCR増幅DNAを分離する方法を示します。アガロースゲルはモレキュラーシーブとして機能し、負に帯電したDNAを印加電場下でそのサイズに基づいて移動させることができます。

プロトコル

1. ゲル電気泳動によるPCRアンプリコンの確認

1. メーカーの推奨に従って、試験するPCR反応の数に適した1xトリス-ホウ酸-EDTA(TBE)バッファーに1.5%(w / v)アガロースゲルを調製します。キャスティングに先立ち、ゲル溶液50 μLにつき蛍光核酸色素5 μLを添加し、混合します。キャスティングには適切なトレイとコームを使用し、DNAリファレンスラダー用に適切な数のウェルを空けておきます。
2. 硬化後、ゲルをGEシステムの1x TBEバッファーに浸します。5 μLのPCR産物と2 μLのローディング色素を混合し、ゲルウェルに移します。参照用に空のウェルに5 μLのDNAラダーを加えます。
3. ゲルを15 cmあたり110 Vで約1時間泳動し、UVベースのゲルイメージング/視覚化システムを使用して、PCRアンプリコンを表す複数(最大5つ)のバンドの存在を確認します(図1の例を参照)。ゲルを捨てます。残りのPCR産物は、さらなる処理が行われるまで4°Cで保存してください。

結果

図1:複数のPCR産物の存在を確認するゲル電気泳動。この画像は、サンプルを含む12のレーンすべてに複数のPCRアンプリコンが存在することを確認しており、最初のレーンは使用されたDNAラダーを表しています。選択したラダーフラグメントのサイズが示されており、各レーンのPCRアッセイと菌株の所属が示されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース、ユニバーサル、peqGOLD	VWRの	732-2789P/732-2788
トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)バッファー	NAの	NAの	標準レシピ、自社製。
DNAゲルローディング染料(6X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R0611
ゲル電気泳動システム	お好みで	NAの
GelRed Nucleic Acid Stain、10,000X 水溶液	ビオチウム	41003	蛍光核酸色素
GeneRuler 50 bp DNA ラダー、すぐに使用可能	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SM0373	DNAラダー
UVベースのゲルイメージング/視覚化システム	お好みで	NAの

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