キャピラリー電気泳動:蛍光標識ポリメラーゼ連鎖反応アンプリコンの解析技術

要約

出典:Gulla, S. et al., マルチローカス マルチPCRおよびキャピラリー電気泳動による魚病原性細菌Yersinia ruckeriの可変数タンデムリピート分析。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、さまざまなサンプルから得られた蛍光標識されたPCRアンプリコンをサイズに基づいて分析するキャピラリー電気泳動の手法について説明しています。これは、各フラグメントの標識蛍光色素の助けを借りてフラグメントの塩基対の長さを決定する遊走パターンを生成します。

プロトコル

1. キャピラリー電気泳動のセットアップと実行条件

1. PCRアンプリコンの確認後、PCR産物を精製水で1:10(v/v)希釈します。密封し、混合し、短時間遠心分離します。
2. ヒュームキャビネットで作業し、PCR 産物ごとに 9 μL のホルムアミドと 0.5 μL のサイズ標準液からなるマスターミックスを調製します (10% の余剰容量を許容します)。0.5 μL の希釈 PCR 産物を添加する前に、利用可能な CE システムに適したプレート上のウェルに 9.5 μL を短時間ボルテックスします。シール、混合、遠心分離機を短時間
   注意: 取り扱いには注意してください。ホルムアミドを水と混合すると、毒性のあるギ酸が生成されます。
3. PCRサーマルサイクラーを使用して、サンプルを95°Cで3分間変性させた後、4°Cまで無期限に冷却します。短時間遠心分離し、製造元の指示に従ってプレートを校正済みのCEシステムにロードします。
4. 選択した装置に適した試薬を使用して、フラグメント解析 CE を実行し、次の設定を行います:60 °C、1.6 kV (32 V/cm) で 5 秒の注入、15 kV (300 V/cm) で 32 分間の時間。24キャピラリー(50 cm)上の24ウェルのCEフラグメント分析には、通常約50分かかります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Avant 3500xL ジェネティックアナライザー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A30469の	キャピラリー電気泳動フラグメント分析に使用されます。
GelRed Nucleic Acid Stain、10,000X 水溶液	ビオチウム	41003	ゲル電気泳動の際に使用する蛍光核酸色素です。
GeneMapperソフトウェア5	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4475073	キャピラリー電気泳動からのエレクトロフェログラムの読み取りに使用されます。
GeneScan 600 LIZ 色素 サイズ標準 v2.0	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4408399	キャピラリー電気泳動時に使用されるサイズ標準。
ハイディホルムアミド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4440753 4311320	キャピラリー電気泳動中に使用される脱イオンホルムアミド。作業用アリコートを準備します。
ミリQウォーター	NAの	NAの	PCRおよびキャピラリー電気泳動中に使用される精製水。標準レシピ;自社生産。
3500 DX/3500xL Dx ジェネティックアナライザー用 POP-7 ポリマー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A26077/4393713/4393709	キャピラリー電気泳動中に使用される分離マトリックス。
UVベースのゲルイメージング/視覚化システム	必要に応じて。	NAの
ボルテクサー	必要に応じて。	NAの