アルカリ性単一細胞ゲル電気泳動:化学療法後の個々の癌細胞におけるDNA損傷の定量的推定のための高感度技術

要約

出典: Lu, Y., et al. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオでは、ドキソルビシン処理細胞における一本鎖および二本鎖DNA切断を定量するためのアルカリ性単一細胞電気泳動アッセイを実演します。アルカリ性条件では、DNA塩基対間の水素結合が破壊され、DNA鎖が完全にほどかれて分離します。これにより、電気泳動時にアガロースゲル中の損傷していないDNA断片と損傷したDNA断片の異なる移動が可能になり、円形の彗星頭を形成する損傷していないDNA断片がゆっくりと移動し、損傷したDNA断片が細長い彗星尾を形成する彗星型の構造が明らかになります。

プロトコル

1. 試薬の準備

1. 1x PBSの
   1. 100 mL 10x PBSを900 mL dH₂Oで希釈し、pHメーターを使用してpHを7.4に調整します。室温で保存してください。
2. 溶解液(LS)
   1. 2.5 mL NaCl、100 mM 二ナトリウム EDTA、10 mM Tris 塩基、および 200 mM NaOH を 900 mL dH₂O 中に調製し、混合物が完全に溶解するまでに通常約 20 分かかります。pHメーターを使用してpHを10に調整します。1%ラウリルサルコシン酸ナトリウムと1%Triton X-100を加え、最終容量を1,000mLに調整します。使用前に少なくとも30分間4°Cに冷却してください。
3. アルカリ電気泳動液(AES)、pH >13
   1. 200 mM NaOHおよび1 mM二ナトリウムEDTAを800 mL dH₂O中に調製し、pHを調整し、pH >13であることを確認します。最終容量を1,000mLに調整します。使用前に新鮮にし、使用前に少なくとも30分間4°Cに冷却してください
4. 染色液
   1. 1. 30 mL Tris-EDTAバッファー(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA二ナトリウム、pH 7.4)に1 μL 10,000倍緑色蛍光核酸染色剤(SYBR Greenなど)を加え、4°Cで保存します。
5. 1%低融点アガロース
   1. 1%低融点アガロース(100mL dH₂O中1g)を電子レンジで溶解します。アガロースを15〜20秒ごとに渦巻いて、アガロースが完全に溶けていることを確認します。アガロースを37°Cのウォーターバスに少なくとも20分間置いてから使用してください。
6. 温まるピペットのヒント
   1. P200ピペットチップの細い端を3 mm切り取り、37°Cで温めてからアガロースをピペッティングします。

2. 彗星のスライドを準備する

1. スライドコーティング
   1. 1%アガロース(100mL dH₂O中1g)を電子レンジで2〜3分間、またはアガロースが完全に溶融するまで溶解します。ガラス顕微鏡スライドをアガロースに浸し、糸くずの出ないワイプを使用してスライドの片側を拭きます。
   2. スライドを平らな面に置いて風乾するか、50°Cで加熱して乾燥を早めます。乾燥後に透明なアガロース膜を形成する必要があります。コーティングされたスライドを37°Cに置いてから使用してください。
2. 単一細胞懸濁液の調製
   1. 神経膠腫細胞の培養と治療
      1. 10% FBS、100 U/mL ペニシリン、および 10 μg/mL ストレプトマイシンを添加した DMEM-Ham F-12 培地で U251 MG 細胞を 37°C で 5% CO₂ で培養します。
      2. 1 mLのトリプシンを使用して細胞を3分間消化し、DMEM-Ham F-12培地とFBSを使用してトリプシンを中和します。15 mLチューブに集め、300 x gで4分間遠心し、培地を吸引し、細胞を1x PBSで2 x 10⁵細胞/mLで懸濁します
         手記：細胞サンプルはアッセイを開始する直前に調製し、すべてのサンプルは光によるDNA損傷を防ぐために、暗い環境または暗い環境で取り扱う必要があります。
      3. 細胞懸濁液を1%溶融低融点アガロース(37°C)と1:10(v/v)の比率で混合し、ピペッティングで上下させて穏やかに混合し、すぐにアガロースコーティングスライドに30μLをピペットで移します。ピペットチップの側面を使用して、アガロース/細胞混合物を広げ、薄い層の形成を確実にします。
      4. スライドを4°Cの暗所に10分間平らに置きます。ゲル化時間を30分に増やすと、高湿度環境でのサンプルの付着が向上します。
      5. スライドを4°C LSの暗闇に1時間から一晩浸します。
3. シングルセル電気泳動
   1. アルカリコメットアッセイ用
      1. LSからスライドを静かに取り出し、余分なバッファーを排出し、AESに4°Cで1時間静かに浸してDNAを巻き戻します。スライドは暗くしてください。
      2. 電気泳動スライドトレイに予め冷却したAESを追加し、スライドの0.5 cmを超えないようにし(これは電気泳動ユニットのサイズによって異なります)、スライドを内側に置き、キャップで覆います。電源電圧を1V/cm(電極間の長さ)に設定し、4°Cで30分間運転します。
      3. スライドから余分な電気泳動溶液を排出します。スライドをdH₂Oに2回、室温で5分間、静かに浸
      漬します。
      4. スライドを70%エタノールに室温で5分間静かに浸します。染色に進みます。
4. ステインコメットスライド
   1. 暗所で37°Cで10〜15分間スライドを乾燥させます。
   2. 乾燥した各アガロースに50 - 100 μLの緑色蛍光核酸染色溶液を室温で15分間染色します。
   3. スライドをdH₂Oで短時間すすぎ、暗所で37°Cで完全に乾燥させます。画像の取得と解析に進みます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x PBS(Ca++, Mg++ フリー)	テクノバ	P0196
NaCl	シグマ	S5886
EDTAの	テクノバ	E0308
トリズマベース	シグマ	T1503
NaOH	シグマ	72068
ラウリルサルコシン酸ナトリウム	シグマ	L7414
トリトンX-100	シグマ	93443
SYBRグリーン	インビトゲン	S33102
低融点アガロース	インビトゲン	16520
アガロース	インビトゲン	16500
95%エタノール	ワーナー・グラハム	#64*17*5
トリプシン	ギブコ	〒25300-054
ガラスティッシュスライド	電子顕微鏡科学	63422から11
キムワイプ	キマンバリー・クラーク
1.5 mL 微量遠心チューブ	デンビル
ピペットのヒント	鋭い
マイクロ波	アヴァンティ
ウォーターバス	精度
横型電気泳動チャンバー	トレビゲン	コメットアッセイ ES II
電源	バイオ・ラッド
孵卵器	クインシーラボ	モデル 12-140E
蛍光顕微鏡	ツァイス	LSM700
マイクロピペッター	エッペンドルフ

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