PCR産物のフラグメントサイジングのためのマイクロ流体キャピラリー電気泳動:サイズに基づいてDNAフラグメントを分離するためのマイクロチップベースの電気泳動分離技術

要約

出典:Wang, H., Zhu et al.脆弱X精神遅滞-1遺伝子におけるシトシン-グアニン-グアニントリヌクレオチドリピートを定量するための堅牢なポリメラーゼ連鎖反応ベースのアッセイ。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、PCRアンプリコンをサイズに基づいて分離するマイクロ流体キャピラリー電気泳動技術について説明しています。この手法は、蛍光色素と標準的な分子サイズマーカーを使用したフラグメントサイジングに役立ちます。

プロトコル

1. PCR産物のフラグメントサイジング

1. 開始する前に、DNA色素濃縮物、DNAゲルマトリックス、DNAマーカー、DNAラダー、精製DNAサンプルを室温で30分間平衡化します。
2. プライミングステーションのセットアップ
   1. 新しい試薬のバッチを使用する場合は、シリンジを交換してください(材料の表を参照)。
   2. ベースプレートを調整し、シリンジクリップのレバーを放して、上の位置までスライドさせます。
3. サイジングソフトウェア(材料表を参照)を起動し、ゲル色素ミックスを調製します。
4. ボルテックス染料を10秒間濃縮し、スピンダウンします。25 μLの色素をゲルマトリックスバイアルに加えます。混合溶液をよくボルテックスし、スピンダウンします。
   1. ゲル色素ミックスをスピンフィルターに移します。スピンフィルターを微量遠心分離機に入れ、室温で1,500 x g ± 20%で10分間遠心します
      注:溶液を染料で光から保護し、使用後は4°Cで保存してください。ゲル染料ミックスは、一度調製すると約15チップに使用できます。ゲル染料混合物を室温まで毎回30分間平衡化してから使用してください。
5. ゲル染料ミックスをロードします
   1. プライミングステーションに新しいDNAチップを挿入します。「G」とマークされたウェルに9μLのゲル染料ミックスを加えます。プランジャーが1 mLマークに配置されていることを確認してから、プライミングステーションを閉じてください。
   2. シリンジプランジャーをクリップに固定されるまで押し下げます。ちょうど30秒待ってから、クリップを放します。5 秒待ってから、プランジャーをゆっくりと 1 mL の位置に戻します。
   3. プライミングステーションを開き、「G」とマークされたウェルに9μLのゲル染料混合物を加えます。
6. はしご記号でマークされたウェルに5μLのマーカーを追加し、さらに12のサンプルウェルのそれぞれに5μLのマーカーを追加します。井戸を空のままにしないでください。
7. 1 μLのDNAラダーを、ラダー記号でマークされたウェルに加えます。1 μL の PCR 産物 (使用済みウェル) または 1 μL の超純水 (未使用のウェル) を 12 個のサンプルウェルのそれぞれに加えます。チップをボルテックスミキサーのアダプターに水平に置き、示された設定(1 rpm)で2,400分間ボルテックスします。
8. チップをバイオアナライザー機器に挿入し、5分以内にチップを機器で実行します。
9. アッセイが完了したら、すぐに使用済みのチップを装置から取り出します。
10. 350 μLの脱イオン水を電極クリーナーのウェルの1つにゆっくりと加えます。バイオアナライザーの蓋を開けて、電極クリーナーを入れます。蓋を閉め、約10秒間インキュベートします。蓋を開けて電極クリーナーを取り外します。電極上の水が蒸発するまでさらに10秒待ってから、蓋を閉めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agilent 2100 バイオアナライザー装置:0.2 mL PCR チューブ	アクシゲン	PCR-02D-Cの
Agilent 2100 バイオアナライザー装置: 1x TE バッファー、pH 8.0、Rnase フリー	アンビオン	AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer 装置: 2100 Bioanalyzer 装置	アジレント	G2939AA
Agilent 2100 バイオアナライザー装置:96 ウェル PCR プレート	サーモフィッシャー	AB0800
Agilent 2100 バイオアナライザー装置:電極カートリッジ	アジレント		2100バイオアナライザー機器の機器を供給し
Agilent 2100 バイオアナライザー装置: IKA ボルテックスミキサー	アジレント		2100バイオアナライザー機器の機器を供給し
Agilent 2100 Bioanalyzer 装置: サイジングソフトウェア 2100 Expert ソフトウェア	アジレント		2100バイオアナライザー機器の機器を供給し
Agilent 2100 バイオアナライザー装置: テストチップ	アジレント		2100バイオアナライザー機器の機器を供給し
Agilent DNA 7500キット	アジレント	〒5067-1506	フラグメントサイジングの場合
Agilent DNA 7500 キット: DNA 7500 ラダー (黄色のキャップ)	アジレント		キット内:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500 キット: DNA 7500 マーカー (グリーンキャップ)	アジレント		キット内:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500 キット: DNA チップ	アジレント		キット内:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500キット:DNA色素濃縮物(ブルーキャップ)	アジレント		キット内:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial(レッドキャップ)	アジレント		キット内:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500 キット: 電極クリーナー	アジレント		キット内:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500 キット: スピンフィルター	アジレント		Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)の供給
Agilent DNA 7500 キット:シリンジ	アジレント		Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)の供給
チッププライミングステーション	アジレント	〒5065-4401	2100バイオアナライザー機器の機器を供給し
フィルタープレート真空マニホールド:MultiScreenHTS真空マニホールド	メルクミリポア	MSVMHTS00	PCR産物精製用フィルタープレート真空マニホールド用真空計器
フィルタープレートバキュームマニホールド:シリコンストッパー	メルクミリポア	XX2004718	フィルタープレート真空マニホールド
フィルタープレート真空マニホールド:真空ポンプ	メルクミリポア	WP6122050	フィルタープレート真空マニホールド
フィルタープレート真空マニホールド:廃棄物収集容器	メルクミリポア	XX1004705	フィルタープレート真空マニホールド

の ます ます ます ます ます