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1. ヨードアセトアミドを使用した遊離システイン残基のブロッキング
- 10%ウシ胎児血清と1%ピルビン酸ナトリウムを含む高グルコースを含む最小必須培地で、5%CO2で6cm2皿中のU-2OS細胞を50%〜60%のコンフルエントに増殖させます。
- 使用直前に10 mMヨードアセトアミドを新たにストックし、未使用の試薬は廃棄してください。
- 最終濃度0.1 mMのヨードアセトアミドを細胞培養培地に直接添加します。皿を室温で2分間静かに揺らします。
2. セルの収集
- 細胞から培地を吸引します。
- 細胞を5 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。最終的なPBS洗浄液を吸引し、冷たいPBS1mLを加えます。
- セルスクレーパーを使用して、皿の底からセルをこすり落とします。1 mLピペットを使用してPBSと細胞懸濁液を引き上げ、すべての液体を1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。
- 細胞を7,500 x gで4°Cで3分間回転させ、PBSを吸引し、細胞ペレットを残します。セルペレットは、処理まで-80°Cで保存できます
3.タンパク質の抽出
- ddH2Oで希釈した1x溶解バッファー100 μLを調製します(材料表を参照)。使用直前にフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を最終濃度1 mMまで添加します。
- 50 μLの1x Lysis Bufferを細胞ペレットに直接加え、懸濁してください。これを氷上で5分間インキュベートします。
- 40%の定パルスモードを使用して8秒間超音波処理し(超音波処理器の材料表を参照;必要に応じて必要に応じて調整します)、抽出物を氷上に保ちます。
- 抽出物を4°Cで5分間、16,000 x gで遠心します。上清は可溶性タンパク質画分です。必要に応じて、ブラッドフォード分析を実行してタンパク質濃度を決定できます。
4.サンプル調製
- 可溶性タンパク質抽出物10 μLを手に取り、1x Laemmli SDSサンプルバッファー(4% SDS、20%グリセロール、0.004%ブロモフェノールブルー、0.125 M Tris-HCl、pH 6.8)10 μLを加えます。還元試薬は添加しないでください。
- その日にSDS PAGE分析を行う場合は、サンプルを氷上に置いておき、長期保存する場合は-20°Cが適切です。ゲルを泳動する直前に、サンプルを85°Cで5分間加熱します。
>5. U-2 OS細胞における内因性タンパク質のin vivoホルムアルデヒド架橋
- 175 cm2フラスコでU-2 OS細胞を70%〜80%のコンフルエント度まで増殖させます。
- ホルムアルデヒド架橋反応を行います
- ドラフトで、市販の供給源から購入した37%ホルムアルデヒド溶液を分注します。ホルムアルデヒド固定液を最終濃度1%になるまで培地に直接加え、室温で穏やかに撹拌しながら15分間インキュベートします。
- 反応を急冷するには、1.25 Mグリシンを最終濃度0.125 Mまで添加し、ロッカー上で穏やかに撹拌しながら室温で5分間インキュベー
トします。
- 細胞を5mLの冷たいPBSで3回洗浄します。最終的なPBS洗浄液を吸引し、10 mLのPBSを加えます。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底からセルをこすり落とします。
- 10 mLピペットを使用して、PBSと細胞懸濁液を引き上げ、液体全体を15 mLの円錐形遠心チューブに分注します。細胞を500 x gで2分間、4°Cで回転させ、PBSを吸引し、細胞ペレットを残します。
6. 原子核の分画
- 10 mLのホモジナイズバッファー(0.25 Mスクロース、1 mM EDTA、10 mM HEPES、および0.5% BSA)をpH 7.4で調製します。使用直前にPMSFを最終濃度1 mMおよび3 mLの核懸濁液バッファー(0.1% Triton X-100 in PBS)に添加します。
- 5 mLの均質化緩衝液を細胞ペレットに直接加え、完全に懸濁します。懸濁液を500 x gで2分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てます。
- ペレットを5 mLの均質化緩衝液に懸濁します。ぴったりとフィットするガラステフロンホモジナイザーを使用し、10ストローク/ 500rpmで細胞を均質化します。
- 懸濁液を1,500 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます
注:ミトコンドリアの単離には、上清を10,000 x gで10分間遠心分離して使用します。
- ペレットを1 mLの核懸濁液バッファーに懸濁し、氷上で10分間インキュベー
トします。
- 600 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。
- ペレットを1 mLの核懸濁液バッファーに懸濁し、再度遠心分離します。上清を捨てます。最終的なペレットは単離された原子核になります。
>7. タンパク質の抽出
- セクション4を繰り返しますが、ただし、25 μLの1x溶解バッファーを細胞ペレットに直接加えてから懸濁します。
8. サンプル調製
- 可溶性タンパク質抽出物をそれぞれ10 μLずつ取り、10 μLの2x Laemmli SDSサンプルバッファーと1 μLの2-メルカプトエタノール(BME)を加えて、SDS-PAGE用の2つのサンプルを調製します。
- 1つのサンプルを37°Cで5分間加熱し、2つ目のサンプルを98°Cで15分間加熱して、ホルムアルデヒド架橋を逆にします。
9.SDS-PAGE分析
- 1x Tris-グリシンランニングバッファー(25 mM Tris、192 mM Glycine、0.1% (w/v) SDS) 1 L を調製します。
- SDS-PAGE走行装置のセットアップ.
注:このプロトコルは、16%プレキャストTGX SDS-Pageを使用します。注目すべきは、任意のパーセンテージのゲルを使用できることです。
- メーカーのプロトコルに従って、ゲルが保管されているパッケージを開き、カセットを取り出します。
- ウェルとテープを裏打ちしているコームをカセットの底から取り外します。
- ゲルをランニング装置に入れます。
- ウェルが液体に沈むまで、チャンバーに1xランニングバッファーを充填します。プラスチック製のピペットを使用して、ランニングバッファーでウェルを洗い流します。
- サンプルを10 μLの染色済み標準マーカーとともにゲルにロードします。
- ゲルの前面がゲルの底から約1cmになるまで、ゲルを200Vで泳がせます。