液相等電点電気泳動:粗Gymnema sylvestre抽出物から生理活性分子を分離する電気泳動技術

要約

出典:Veerapandian, R., et al.分取等電点泳動(IEF)法による生物活性小分子、天然源からのペプチド、および微生物からのタンパク質の分離。J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、液相等電点電気泳動を使用して植物抽出物から複雑な分子を分離する技術について説明しています。この技術は、複雑な生体分子を天然の状態で精製するのに役立ち、さまざまなダウンストリームアプリケーションに使用できます。

プロトコル

>1. Gymnema sylvestre抽出物からの低分子およびペプチドの分離と精製

1. 0.6gの植物抽出物を測定し、ローラーチューブで5分間混合して蒸留水(60mL)に溶解します
   注:可溶性で塩分を含まない生体サンプルは、液相等電点電気泳動(IEF)装置を使用して分離および精製に使用できます。最大10 mMの緩衝塩濃度のサンプルは、分解能をわずかに低下させて使用できます。
2. 可溶化した植物抽出物を10,000 x gで5分間遠心分離し、不溶性粒子を除去します。
3. 上清(~60 mL)を80 mLの遠心チューブに移し、0.6 mLの両性電解質(pH 3-10)と1%(v/v)に混合します。
4. 液相IEFユニットを準備します。
   1. 液相IEF電極(アノードレッドボタンとカソードブラックボタン)を、取扱説明書(材料表)に従って、それぞれの交換膜と組み立てます。新しい膜を使用する場合は、陰イオン交換膜を0.1 M NaOHで、陽イオン交換膜を0.1 MH₃PO₄で少なくとも16時間平衡化します。
   2. メンブレンは、ランとランの間に電解質(0.1 M NaOHまたは0.1 MH₃PO₄)に保管し、乾燥させないでください。
   3. イオン交換ガスケットの3つの長方形の穴を揃えて、電極の内側と外側を組み立てます。電極にそれぞれの電解質(~25-30 mL)を充填し、メンブレンが乾燥するのを防ぎます。
   4. 電極内部に圧力がかかり、漏れの原因となる可能性のある過剰な電解液(電極チャンバー容積の1/3以上)を追加しないでください。
   5. サンプル収集ポートを、機器組立部品に付属のシーリングテープで覆います(材料表)。サンプル収集ポート側は、2つの垂直な金属位置合わせピンで識別できます。または、標準のシーリングテープを使用してポートをシールします。
   6. フォーカシングチャンバーアセンブリのすべての部品(アノード電極、ナイロン膜コア、フォーカシングチャンバー、カソード電極)をセラミック冷却フィンガー上で順番に組み立てます。
   7. 50 mLシリンジを使用して、予冷した蒸留水(標準的なIEFセルで合計容量60 mL)をフォーカシングチャンバーに充填します。
   8. 液相IEF装置を4°Cの循環冷却水に接続し、15Wおよび3,000Vでユニットを3〜5分間、または電圧が安定するまで事前運転します
      注意: 通常、1分以内に、電圧は最大設定値に達します。蒸留水でプリランニングすると、集光チャンバーとナイロン膜コアから残留イオンを除去するのに役立ちます。
   9. 電源を切り、フラクションコレクターを使用してセルから水を取り除きます。収集ポートをシーリングテープで再度密封します。これで、チャンバーにサンプルをロードする準備が整いました。
5. 1-1/2インチの19 G鈍いエンドニードル(装置に付属)を備えた50 mLシリンジを使用し、調製したサンプルに両性電解質(合計60 mL)をサンプル収集ポートを介してセル内にロードします。
6. サンプルセルから気泡を取り除くには、集束セルをスタンドから取り外し、電極チャンバーを軽くたたいて気泡を取り除きます。気泡の存在は、電圧と電流の変動を引き起こし、運転に影響を与えます。
7. ユニットを水冷却剤(4°C)に接続し、一定の15Wで電源で分画を開始します。
8. 装置を3時間または電圧が一定の値に達するまで運転します
   注:サンプルがフォーカスを開始すると、電圧は一定の値に達するまで徐々に上昇し始めます。
9. 実行後、IEFユニットのハーベストボタンをONにして、真空ポンプに接続されたハーベストボックス(20本のプラスチックチューブ、12 mm x 75 mm、容量5〜6 mL)にフラクションを収集する準備をします。
10. 20 収集ピンを、テープで密封されているフォーカシング セルの 20 収集ポートに合わせます。
11. シーリングテープに収集ピンを押し込み、真空ポンプを同時にオンにします(図1B、1C、1D).
    注:各チャンバーから約3mLのフラクションが毎回チューブに収集されます。フラクションは、その後の下流アプリケーション(ペプチド定量のためのSDS-PAGE、低分子のためのTLCおよびバイオアッセイ)に使用することができます。

結果

図1:液相IEF装置のセットアップとG. sylvestre植物抽出物の分画。(A)運転中、(B)フラクション回収中、(C)フラクション回収後、(D)液相IEF装置部品、1)イオン交換膜、2)集束室と膜コア、3)電極組立体(ネガティブ)、4)電極組立体(ポジティブ)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.45 μm シリンジフィルター	フィッシャーサイエントフィック	09-720-004
Bio-Lyte 3/10 両性状物質	バイオ・ラッド	〒163-1113
Bio-Lyte 5/8 両性状物質	バイオ・ラッド	〒163-1192
コンパクトな低温サーモスタット	ラウダ・ブリンクマン	RM 6T	水冷を4°Cに設定すると、Rotofor冷却コアを通過すると、電圧にもよりますが、循環水温が5°C以上になるため、0°Cでも運転できます。
ギムネマ植物葉エキス末(>25%ギムネマ酸)	スアン・ファルマ、ニュージャージー州、米国
ミニプロティアン電気泳動	バイオ・ラッド
pHメーター	メトラー・トレド	S20	Rotofor(液相IEF)画分のpHを測定するのに有用
ロトフォー	バイオ・ラッド	〒170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf(ユニットを組み立てるためのロトフォー取扱説明書)
RPMI-1640 ミディア	ハイクローン	01 DH30255月
シーリングテープ	バイオ・ラッド	〒170-2960	スコッチテープも使用できます
Sorvall legend micro 17遠心分離機	サーモサイエンティフィック	75002432

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