液相等電点電気泳動:粗Gymnema sylvestre抽出物から生理活性分子を分離する電気泳動技術

>1. Gymnema sylvestre抽出物からの低分子およびペプチドの分離と精製

1. 0.6gの植物抽出物を測定し、ローラーチューブで5分間混合して蒸留水(60mL)に溶解します
   注:可溶性で塩分を含まない生体サンプルは、液相等電点電気泳動(IEF)装置を使用して分離および精製に使用できます。最大10 mMの緩衝塩濃度のサンプルは、分解能をわずかに低下させて使用できます。
2. 可溶化した植物抽出物を10,000 x gで5分間遠心分離し、不溶性粒子を除去します。
3. 上清(~60 mL)を80 mLの遠心チューブに移し、0.6 mLの両性電解質(pH 3-10)と1%(v/v)に混合します。
4. 液相IEFユニットを準備します。
   1. 液相IEF電極(アノードレッドボタンとカソードブラックボタン)を、取扱説明書(材料表)に従って、それぞれの交換膜と組み立てます。新しい膜を使用する場合は、陰イオン交換膜を0.1 M NaOHで、陽イオン交換膜を0.1 MH₃PO₄で少なくとも16時間平衡化します。
   2. メンブレンは、ランとランの間に電解質(0.1 M NaOHまたは0.1 MH₃PO₄)に保管し、乾燥させないでください。
   3. イオン交換ガスケットの3つの長方形の穴を揃えて、電極の内側と外側を組み立てます。電極にそれぞれの電解質(~25-30 mL)を充填し、メンブレンが乾燥するのを防ぎます。
   4. 電極内部に圧力がかかり、漏れの原因となる可能性のある過剰な電解液(電極チャンバー容積の1/3以上)を追加しないでください。
   5. サンプル収集ポートを、機器組立部品に付属のシーリングテープで覆います(材料表)。サンプル収集ポート側は、2つの垂直な金属位置合わせピンで識別できます。または、標準のシーリングテープを使用してポートをシールします。
   6. フォーカシングチャンバーアセンブリのすべての部品(アノード電極、ナイロン膜コア、フォーカシングチャンバー、カソード電極)をセラミック冷却フィンガー上で順番に組み立てます。
   7. 50 mLシリンジを使用して、予冷した蒸留水(標準的なIEFセルで合計容量60 mL)をフォーカシングチャンバーに充填します。
   8. 液相IEF装置を4°Cの循環冷却水に接続し、15Wおよび3,000Vでユニットを3〜5分間、または電圧が安定するまで事前運転します
      注意: 通常、1分以内に、電圧は最大設定値に達します。蒸留水でプリランニングすると、集光チャンバーとナイロン膜コアから残留イオンを除去するのに役立ちます。
   9. 電源を切り、フラクションコレクターを使用してセルから水を取り除きます。収集ポートをシーリングテープで再度密封します。これで、チャンバーにサンプルをロードする準備が整いました。
5. 1-1/2インチの19 G鈍いエンドニードル(装置に付属)を備えた50 mLシリンジを使用し、調製したサンプルに両性電解質(合計60 mL)をサンプル収集ポートを介してセル内にロードします。
6. サンプルセルから気泡を取り除くには、集束セルをスタンドから取り外し、電極チャンバーを軽くたたいて気泡を取り除きます。気泡の存在は、電圧と電流の変動を引き起こし、運転に影響を与えます。
7. ユニットを水冷却剤(4°C)に接続し、一定の15Wで電源で分画を開始します。
8. 装置を3時間または電圧が一定の値に達するまで運転します
   注:サンプルがフォーカスを開始すると、電圧は一定の値に達するまで徐々に上昇し始めます。
9. 実行後、IEFユニットのハーベストボタンをONにして、真空ポンプに接続されたハーベストボックス(20本のプラスチックチューブ、12 mm x 75 mm、容量5〜6 mL)にフラクションを収集する準備をします。
10. 20 収集ピンを、テープで密封されているフォーカシング セルの 20 収集ポートに合わせます。
11. シーリングテープに収集ピンを押し込み、真空ポンプを同時にオンにします(図1B、1C、1D).
    注:各チャンバーから約3mLのフラクションが毎回チューブに収集されます。フラクションは、その後の下流アプリケーション(ペプチド定量のためのSDS-PAGE、低分子のためのTLCおよびバイオアッセイ)に使用することができます。

図1:液相IEF装置のセットアップとG. sylvestre植物抽出物の分画。(A)運転中、(B)フラクション回収中、(C)フラクション回収後、(D)液相IEF装置部品、1)イオン交換膜、2)集束室と膜コア、3)電極組立体(ネガティブ)、4)電極組立体(ポジティブ)。