Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis:タンパク質-リガンド複合体の異なる移動に依存するサンプル-リガンド相互作用の解析法

要約

出典:Nachbar M. et al., キャピラリーゲル電気泳動およびアフィニティーキャピラリー電気泳動によるAtHIRD11天然変性および金属イオンへの結合の解析。J. Vis. Exp.(2018年)。

この動画では、移動度シフトアフィニティーキャピラリー電気泳動によるタンパク質-リガンド相互作用の解析方法について説明しています。この方法は、さまざまな荷電リガンドを持つタンパク質の結合挙動を特徴付けるために使用できます。

プロトコル

1. ACE解析用の解を準備します。

1. 1 M NaOH溶液を調製します。
   1. 100 mLメスフラスコに4.0 gのNaOHを秤量します。
   2. マークまで脱イオン水で満たし、1 Mストックを作成します。
2. 0.1 M エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を 0.1 M NaOH 溶液中で調製します。
   1. 10 mLバルブピペットを使用して、10 mLメスフラスコに10 mLの0.1 M NaOHを移します。脱イオン水でマークまで満たします。
   2. 秤量ボートで2.42 gのEDTAを秤量し、固体化合物を0.1 M NaOHの100 mLに溶解します。
3. Trisバッファー(30 mM)溶液を調製します。
   1. 3.63 gのトリス、200 mLの脱イオン水、および500 mLビーカーに攪拌子を加えます。.ビーカーを攪拌機に置き、スイッチを入れます。
   2. ビーカーにpHメーター電極を入れ、0.1 M HClを使用してpHを7.4に調整します。
   3. 溶液を1Lメスフラスコに充填し、脱イオン水でマークまで満たします
      注:この手順を繰り返すか、全体の分析に1L以上が必要なため、より大きな容量のフラスコが必要になります。
4. アセトアニリド電気浸透流(EOF)マーカー(60 μM)溶液を調製します。
   1. 6 mgのアセトアニリドと100 mLのTrisバッファーを100 mLメスフラスコに加えます。
   2. メスフラスコを超音波浴に入れ、30分間スイッチを入れます。
5. サンプル(1 mg/mL)溶液を調製します。
   1. 0.5 mLの微量遠心チューブを精密天びんに載せ、0.3 mgの凍結乾燥AtHIRD11粉末をチューブに加えます。
   2. マイクロピペットを使用して、0.3 mLの30 mM Trisバッファー(pH 7.4)をチューブに加えます。チューブを慎重に振ってタンパク質を溶かします。
6. リガンド溶液を調製します。
   1. CaCl₂(5 mM)ストック溶液を調製します。
      1. 計量ボートを取り、分析天びんに乗せて、36.76 mgのCaCl₂ * H₂Oを計量します。
      2. マイクロピペットを使用して、計量ボートからCaCl₂*H₂Oを、事前に調製したTrisバッファーを入れた50 mLメスフラスコにフラッシュします。
      3. メスフラスコにトリスバッファーをマークまで満たします。
   2. 残りのストック溶液(5 mM)を調製します。
      1. CaCl₂*H₂O [MgCl₂: 23.80 mg, BaCl₂: 26.02 mg, Sr(NO₃)₂: 52.91 mg, MnCl₂: 31.46 mg, SeCl₄: 52.91 mg, CoCl₂*2H₂O: 41.47 mg, CuCl₂*2H₂O: 42.62 mg, ZnCl₂: 3.41 mg, NiCl₂*6H₂O: 59.43 mg].
         手記：ZnCl₂溶液の濃度は0.5mMです。イオンと内毛細血管壁との間に強い相互作用が観察されたため、濃度は10:⁴倍に減少しました。
   3. 500 μM CaCl₂溶液を調製します。
      1. CaCl₂ ストック溶液 10 mL を満たし、100 mL メスフラスコに入れます。
      2. メスフラスコにトリスバッファーをマークまで満たし、フラスコを振ってください。
   4. 250 μM CaCl₂溶液を調製します。
      1. CaCl₂ストック溶液5 mLを満たし、100 mLメスフラスコに入れます。
      2. メスフラスコにトリスバッファーをマークまで満たし、フラスコを振ってください。
   5. 他のストック ソリューションについて、前の手順を繰り返します。
7. バイアルに溶液を充填します.
   手記：繰り返し実行ごとに、インレットバイアルとアウトレットバイアルのセットが必要です。入口と出口で新しい配位子溶液を使用することで、各実行後の移行時間のシフトが短縮されます。
   1. 250 μM CaCl₂溶液を10 mLシリンジに充填します。
   2. 0.22 μm PVDF フィルターをシリンジに置き、シリンジを使用して 2 mL の溶液をフィルターに押し込み、このろ過済み溶液を廃棄します。
   3. 最大許容容量まで10バイアルをシリンジの残りの250μM CaCl₂溶液で満たします。それぞれを 250 μM CaCl₂ 溶液インレットバイアルとしてマークします。
   4. 10本のバイアルを、250μMのCaCl₂溶液で半分満たされるまで満たします。それぞれを250 μM CaCl₂溶液アウトレットバイアルとしてマークします。
   5. 他の金属塩含有溶液について、手順1.7.1〜1.7.4を繰り返します。
   6. インレットバイアルとアウトレットバイアルのすべてのペアについて、代わりに30 mM Trisバッファー(pH 7.4)溶液を使用して手順を繰り返します。
      手記：30 mmol/L Tris buffer pH 7.4 は、金属イオンの非存在下でのタンパク質の移動時間データを取得するために、ランの合間に使用します。EOFの変更を無視する必要があります。
   7. 代わりに、アセトアニリドEOFマーカー(60μM)溶液を使用して、1つのバイアルについて上記の手順を繰り返します。また、代わりにサンプル(1 mg/mL)溶液を使用してこれらの手順を繰り返します。

2. アフィニティーキャピラリー電気泳動分析

1. キャピラリーのコンディショニング
   1. サーモスタットを23°C.
      に設定します 手記：温度は公開されたプロトコルに従って使用され、他の温度に変更することができます。ただし、相互作用は温度に依存し、それに応じて変化します。
   2. キャピラリーを2.5 barで40分間、0.1 M NaOHでフラッシュします。
   3. キャピラリーを脱イオン水で1.0バールで10分間洗い流します。
   4. キャピラリーを30 mM Tris buffer(pH 7.4)を用いて1.0 barで30分間フラッシュします。
2. ACE法の準備
   1. リガンドなしの測定法を準備します.
      手記：アセトアニリドは、2 つのタンパク質ピークを隠すため、サンプル溶液に添加しませんでした。
      1. キャピラリーを 2.5 bar で 1 分間、0.1 M EDTA 溶液ですすいでください。
      2. キャピラリーを脱イオン水で2.5バールで1分間すすぎます。.
      3. キャピラリーをTrisバッファーで2.5バールで1.5分間すすぎ、平衡化します。
      4. アセトアニリド溶液を0.05 barで6秒間注入し、入口と出口のバイアルをトリスバッファーバイアルに交換します。
      5. 0.05 bar を 2.4 秒間塗布して、アセトアニリド溶液をキャピラリーの先端からさらに内側に押し込みます。
      6. 10.0 kVを6分間印加し、200 nmの波長でアセトアニリドピークを検出します。
      7. ステップ2.2.1.1.〜2.2.1.6.を繰り返し、アセトアニリド溶液の代わりにタンパク質サンプルを使用し、すべてのタンパク質ピークを検出します。
   2. リガンドを使用した測定法を準備します。
      1. キャピラリーを 2.5 bar で 1 分間、0.1 M EDTA 溶液ですすいでください。
      2. キャピラリーを脱イオン水で2.5バールで1分間すすぎます。.
      3. キャピラリーをリガンド溶液で2.5バールで1.5分間すすぎ、平衡化します。
      4. アセトアニリド溶液を0.05 barで6秒間注入し、入口および出口バイアルをリガンド含有緩衝バイアルに交換します。
      5. 0.05 bar を 2.4 秒間塗布して、アセトアニリド溶液をキャピラリーの先端からさらに内側に押し込みます。
      6. 10.0 kVを6分間印加し、200 nmの波長でアセトアニリドピークを検出します。
      7. アセトアニリド溶液の代わりにタンパク質サンプルを使用して、ステップ 2.2.2.1 から 2.2.2.6 を繰り返し、すべてのタンパク質ピークを検出します。
   3. ステップ2.2.1と2.2.2を交互に繰り返して、さまざまなタンパク質-金属イオン相互作用の電荷-サイズ比の変化を計算します。
      1. 60時間ごとにタンパク質溶液を新しいものに変更します.
         手記：この時点で、実験を一時停止できます。この手順は、ピークパターンがランごとにわずかに異なるため、リガンドの濃度ごとに少なくとも10回繰り返されます。溶液を60時間より長く使用すると、ばらつきが大きくなりすぎます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AtHIRD11サンプル	静岡大学(グループ教授:原 正彦)		シロイヌナズナ由来のデヒドリンタンパク質、大腸菌で発現
バレフドシリカキャピラリー、	Polymicro Technologies(米国フェニックス)	106815-0017	TSP050375内径50μm、外径363μm、ポリイミドコーティング
アジレント 1600A	Agilent Technologies(ドイツ・ヴァルトブロン)		キャピラリー電気泳動装置;代わりにAgilent 7100 CEを使用できます
バルブピペット 25 mL	Duran Group GmbH(ドイツ・マインツ)	24 338 14	リガンド溶液の調製
デュラングラスメスフラスコ25mL	Duran Group GmbH(ドイツ・マインツ)	24 671 1457	リガンドストック溶液の調製
デュラングラスメスフラスコ10mL	Duran Group GmbH(ドイツ・マインツ)	24 671 1054	リガンドストック溶液の調製
アセトアニリド	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	397229から5G	電気浸透流マーカー
塩化マンガン(II)	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	13217	リガンド
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	431788から100G	リンス成分
塩化バリウム	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	202738-5G	リガンド
塩化ニッケル(II)六水和物	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	654507から5G	リガンド
塩化セレン(IV)	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	323527から10G	リガンド
2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1.3-ジオール(トリス)	Sigma-Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)	252859から100G	緩衝成分
塩化亜鉛(II)	Merck Millipore(ドイツ・ダルムシュタット)	1088160250	リガンド
硝酸ストロンチウム	Merck Millipore(ドイツ・ダルムシュタット)	1078720250	リガンド
塩化カルシウム二水和物	Merck Millipore(ドイツ・ダルムシュタット)	1371015000	リガンド
塩化銅(II)二水和物	リーデル・デ・ハーン(ドイツ、ゼルツェ)	31286	リガンド
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies(ドイツ・ヴァルトブロン)	G2070-91126	CE機器を操作し、データを取得して評価するためのソフトウェアパッケージ