二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動:電荷と分子量に基づく複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の分析のための分離技術

要約

出典:Zhan, X., et al. ヒト下垂体腺腫組織プロテオームの分析のための質量分析法と組み合わせた二次元ゲル電気泳動 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、ヒト非機能性下垂体腺腫(NFPA)の腫瘍組織から得られた複雑なタンパク質混合物から個々のタンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動法を実演します。タンパク質は、最初の次元では電荷に基づいて分離され、さらに2番目の次元では分子量に基づいて分離されます。

プロトコル

1. サンプルの準備

1. 脳神経外科から下垂体腺腫組織(0.2〜0.5 mg)を収集します。すぐに液体窒素で凍結し、-80°Cに移して保存します。
2. 0.9% NaCl 2 mL を脱イオン蒸留水 (ddH₂O) に添加します。この溶液を使用して、組織表面から血液を軽く洗います(3x).
   NOTE:18.2MΩ/cmの導電率を持つddH₂Oは、プロトコル全体で使用されます。ティッシュの表面から血液を洗い流すと、ティッシュの一部が失われる可能性があります。
3. 組織0.5〜0.6gごとに、2M酢酸と0.1%(v / v)β-メルカプトエタノールを含む溶液を容量(10mL;4°C)加え、組織ホモジナイザーでホモジナイザー(1分、13,000rpm、4°C、10x)し、ホモジネートを20秒間超音波処理し、凍結乾燥し、-80°Cで保存します。
4. ビシンコニン酸(BCA)アッセイキットを使用して、凍結乾燥、均質化されたサンプルのタンパク質含有量を測定します.
   手記：BCAの定量化は絶対的な定量ではなく、測定結果は別の技術者と実験エージェントによって変更されます。固定濃度のサンプル標準試料は、さまざまな実験に使用する必要があります。したがって、各2Dゲルのタンパク質の最終的なローディング量は、事前に設計された実験の銀染色またはクーマシー染色された良好な解像度の画像で決定されます。
   1. 凍結乾燥ホモジナイズされたサンプルを1容量(282μL)のタンパク質抽出バッファー(8M尿素および4%CHAPS)に約300μgを加え、続いて2時間放置し、水浴中で5分間超音波処理し、1時間回転させ、再び水浴中で5分間超音波処理し、再度1時間回転させ、 15,000 x gで20分間遠心分離します。
   2. 市販のBSA標準試料(2 mg/mL)を使用して、0、25、125、250、500、750、1,500、2,000 μg/mLの濃度でBSA標準液を調製します。
   3. BCA試薬AとB(A:B = 50:1)をBCAワーキング溶液として混合してから使用してください。
   4. 0.1 mLのサンプルまたは標準溶液を2 mLのBCAワーキング溶液にマイクロチューブで加え、混合した後、37°Cで30分間インキュベートします。最後に室温で10分間冷却し、_A562nmのO.D.値を測定します。
   5. 標準線形線(A_{562 nm} 対 BSA 濃度)を計算して、A_{562 nm} 値でサンプルタンパク質含有量を計算するための回帰式を取得します。
5. 18 cm 固定化 pH グラジエント (IPG) ストリップ pH 3-10 非線形 (NL).
   には、銀染色にはタンパク質相当の凍結乾燥サンプルを 150 μg 使用、クマシー染色にはタンパク質 500 μg を使用します 手記：IPGドライストリップは、厚さ0.5 mm、幅3 mmで、長さは7、11、13、18、24 cm、pH 4-5、4-7、6-9、3-10などのさまざまなpH範囲で、線形または非線形のpH勾配で変化します。使用する IPG バッファーは、ストリップに適合する必要があります。
6. 250 μLの抽出バッファー(7 M尿素、2 Mチオ尿素、4%(w / v)CHAPS、100 mM DTT(使用前に添加)、0.5% v / v医薬品(使用前に添加)、および微量のブロモフェノールブルー)を加えます。
7. 溶液を30°C未満に保ち、続いて5分間ボルテックス、5分間超音波処理、50分間回転させます。
8. 110 μLの再水和バッファー(7 M尿素、2 Mチオ尿素、4%(w / v)CHAPS、60 mM DTT(使用前に添加)、0.5% v / v IPGバッファー(使用前に添加)、および微量のブロモフェノールブルー)を添加します。5分間超音波処理します。次に、サンプルを50分間回転させ、ボルテックスを5分間回転させ、15,000 x gで20分間遠心分離します。
9. 上清(350 μL)をタンパク質サンプル溶液として回収します。

2. 二次元ゲル電気泳動

1. IEF(First dimension):以下に説明するように、等電点電気泳動システムでIEFを実行します。
   1. 350 μLのタンパク質サンプル溶液を18 cm IPGストリップホルダーのスロットに加えます。
   2. 18 cm IPG ストリップをゲル面を下にして、タンパク質サンプル溶液の上に置きます (気泡が入らないようにします)。
   3. IPGストリップを覆うように3〜4mLの鉱油を加えます。
   4. IPGストリップホルダーを、尖った端を背面(+)プレートに、四角い端を前面(-)プレートにして、等電点電気泳動システムに組み立てます。
   5. 一晩中(室温で~18時間)再水和します。
   6. IEFのパラメータを設定します。最大電流はストリップあたり30μA、20°C、250V、1時間、125Vh、ステップ&ホールド、1,000V、1時間、500Vh、グラジエント、8,000V、1時間、4,000Vh、グラジエント、8,000V、4時間、32,000Vh、ステップ&ホールド、500V、0.5h、250Vh、ステップ&ホールド。合計時間7.5時間、36,875Vhまで実行します。
   7. IEFの後、各IPGストリップを取り出し、不溶性のペーパータオルで余分なミネラルオイルを取り除きます。次に、ストリップをラップで包み、-80°C.
      で保管します 手記：IPGストリップホルダーは、IPGストリップホルダーの洗浄液と蒸留水で洗浄する必要があります。
2. SDS-PAGE(2次元):縦型細胞電気泳動システムでSDS-PAGEを実行します
   手記： 各SDS-PAGEゲルサイズは255 x 190 x 1 mmである必要があります。
   1. マルチゲルキャスターを使用して、12% PAGE分離ゲルをキャストします。12% PAGEゲルをキャストするには、以下の手順で行います。
      1. 270 mLのddH₂O、150 mLの1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)、180 mLの40%(w/v)アクリルアミド/ビスアクリルアミドストック溶液(29:1、40% w/vアクリルアミドおよび1.38% w/v N、N'-メチレンビスアクリルアミド)、3 mLの10%過硫酸アンモニウム、および150 μLのTEMEDを加えて、ビーカー中のゲル溶液を調製します。泡を避けて穏やかに混ぜます。
      2. ゲル溶液を予想されるゲル高さ(19 cm)までマルチキャスティングチャンバーに穏やかに注ぎます。
      3. すぐに各分離ゲルに約3 mLのddH₂Oを加えてゲルを覆います。ゲルを約1時間重合させます。
   2. 20 Lの電気泳動バッファー(25 mM Tris、192 mMグリセリン、および0.1% SDS)を調製します。電気泳動分離ユニットのバッファータンクにこのバッファーを満たします。
   3. 集束したIPGストリップをフリーザーから取り出し、4 mLの還元平衡バッファー(375 mM Tris-HCl(pH 8.8)、6 M尿素、2%(w/v)SDS、20%(v/v)グリセロール、2%w/v DTT(使用前に添加)、および微量のブロモフェノールブルー)で穏やかに揺さぶって、ストリップを10分間平衡化します。
   4. 還元したIPGストリップを4 mLのアルキル化平衡バッファー(375 mM Tris-HCl(pH 8.8)、6 M尿素、2%(w/v)SDS、20%(v/v)グリセロール、2.5%w/vヨードアセアミド(使用前に添加)、および微量のブロモフェノールブルー)で静かに揺さぶって10分間平衡化します。
   5. ゲル平衡中に、マルチキャスティングチャンバーを分解し、調製した分離ゲルカセットを取り出します。ddH₂Oで3回すすぎ、不溶性ペーパータオルで余分なddH₂Oを取り除き、ジェルスタンダーに入れます。
   6. 平衡化したIPGストリップを電気泳動バッファーですすぎ、不溶性のペーパータオルでIPGストリップ表面の余分な液体を取り除きます。
   7. 分離部SDS-PAGEゲルにIPGストリップをセットし、IPGストリップのプラスチック面を長いガラスプレートと左の尖った端に接触させます。
   8. 3〜4 mLの熱い1%アガロースをSDS電気泳動バッファー(~80°C)にすばやく注ぎ、各SDS-PAGEゲルの上部にIPGストリップを密封し、IPGストリップの上面を気泡のない短いガラスプレートの上部まで下ろし、10分間重合します。
   9. 組み立てたゲルカセットを垂直電気泳動システムのプラスチックガスケットの間に垂直に挿入します。IPGストリップをカソード(-)の隣に配置して、ゲルの上部を置きます。
   10. 電気泳動バッファーのレベルを調整して、ゲルカセットを浸します。
   11. 電源/制御ユニットを定電圧モードに接続して設定し、染料を監視しながら200Vで約370分間運転します。
   12. 泳動後、電気泳動システムからゲルカセットを取り出し、ゲルが破れないようにゲルを優しく取り出し、続いて2DE分離タンパク質を染色します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エッタンIPGphor 3	GEヘルスケア		等電点集光システム。
エッタンDALTII.システム	Amersham Pharmacia Biotech, ピスカタウェイ, ニュージャージー州, アメリカ		縦型電気泳動システム
Ettan IPGphor ストリップホルダー	Amersham Pharmacia Biotech, ピスカタウェイ, ニュージャージー州, アメリカ
エッタン DALTsix マルチゲルキャスター	Amersham Pharmacia Biotech, ピスカタウェイ, ニュージャージー州, アメリカ		マルチゲルキャスター
キムワイプ	キンビペ		不溶性ペーパータオル
水	PURELABフレックスインストゥルメント製
ポリトロン P710/35 型ホモジナイザー	Brinkmann Instruments、ニューヨーク州ウェストベリー
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23227
2-D クオンツキット	GEヘルスケア	〒80-6483-56
ビスアクリルアミド	アムレスコ	0172
アクリルアミド	アムレスコ	0341
DTTの	シグマ・アルドリッチ	D0632
チオ尿素	シグマ・アルドリッチ	T8656
尿素	ベテック	V900119
SDSの	アムレスコ	0227
荒れ	アムレスコ	0465
テメド	アムレスコ	M146
過硫酸アンモニウム	アムレスコ	M133
IPGバッファーpH 3-10、NL	GEヘルスケア	17-6000-87
イモビリンドライストリップpH 3-10NL、18cm	GEヘルスケア	17-1235-01

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