Zymographyゲル電気泳動:酵素活性を評価することによりマトリックスメタロプロテイナーゼを検出する電気泳動技術

要約

出典:Hu, X. et al., Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography.J. Vis. Exp.(2010年)

このビデオでは、細胞培養上清中に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の活性を評価するためのザイモグラフィーゲル電気泳動技術を示しています。活性MMPは、ポリアクリルアミドゲルに埋め込まれたMMP特異的基質を分解し、染色後、暗い染色された背景に対して透明なバンドとして現れます。

プロトコル

1. ゲルのロードと実行

1. すべてのサンプルは、酵素の機能を維持するために適切に調製し、採取後すぐに使用するか、-80°Cで冷凍保存する必要があります。サンプルには還元剤(β-メルカプトエタノールなど)が含まれていてはなりません。また、ゲルをロードする前に煮沸してはなりません。
2. カセットの中にゲルが入ったポーチを開き、脱イオン水でカセットをすすぎます。
   1. カセットの底から保護テープをはがし、ジェルの上部からコームをはがします。
   2. 流動緩衝液(脱イオン水で1倍に希釈)でウェルを3回すすぎます。
   3. ゲルをミニセルに入れ、カセットの小さい方の面が内側を向くようにします。ゲルテンションウェッジで所定の位置に固定します。Mini-Cellは、1つまたは2つのゲルを並行して泳動させることができます。
   4. 上部(内部)チャンバーにウェルレベルより上の1Xランニングバッファーを充填し、漏れがないか確認します。漏れが発生した場合は、バッファーを取り外し、ゲルを再配置します。
   5. 下部チャンバーに1Xランニングバッファーを充填します。
3. 10 μLのタンパク質分子マーカーを1つのウェルにロードします。
   1. 同量のゲルローディングバッファーとサンプルを混合し、ゲルローディングチップを使用してゲルのウェルにロードします(各サンプル間で交換)。これらのウェルは、合計で最大20μLをロードできます。
4. ミニセルに蓋をし、電極コードを電源に接続します。電源のスイッチを入れ、125 V 定数で 90 分間動作するように設定します。下部チャンバーのワイヤーに小さな気泡が形成され、電流循環を示していることを確認します。
5. 最初のゲルを泳動する際は、ローディングバッファーに含まれるブロモフェノールブルーを指標として、15分ごとに移行の進行状況をモニターします。インジケーター色素がゲルの底に達するまでゲルを流します。

2. ゲルの再生と開発

1. 各ゲルについて、100 mLの1X renaturing bufferと200 mLのdenanuting bufferを、どちらも脱イオン水中で調製します。
2. ブロモフェノールブルートラッキング色素がゲルの底に到達したら、電源を切り、Mini-Cellを開き、ゲルを取り出します。カセットの両側をジェルナイフ(または計量ヘラ)を使用して分離します。角を切ってゲルの方向をマークします。
3. カセットからゲルを慎重に取り出し、100 mLの再生バッファーを入れた容器に入れます。室温で30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベー
トします。
4. 再生バッファーを取り出し、100 mLの現像バッファーをゲルに加えます。室温で30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベー
トします。
5. 現像バッファーを取り出し、ゲルにさらに100 mLの現像バッファーを加えます。37°Cで一晩(16-18時間)インキュベートします。
6. 現像バッファーを取り出し、室温で穏やかに攪拌しながら脱イオン水で3回(各5分)すすぎます。
7. ゲルをスキャンすると、タンパク質標準バンドの正確な位置が保存され、ゲル染色後にタンパク質標準バンドが見えなくなるかします。
8. 20mLのSimplyBlue Safestainをゲルに加えてゲルを染色します。室温で1時間、穏やかに撹拌しながらインキュベー
トします。
9. SimplyBlue SafeStainを取り出し、100 mL以上の脱イオン水でゲルを室温で1時間、穏やかに攪拌しながら脱染します。
10. より良い結果を得るには、新鮮な脱イオン水と交換し、穏やかに攪拌しながら室温でさらに1時間以上インキュベー
トします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Xcell SureLock Mini-Cell CEマーク電気泳動装置	インビトゲン	EI0001
電源(モデル302)	VWRの	93000-744
Novex 10% ゼラチンザイモグラムゲル、1.0 mm、12 ウェル	インビトゲン	EC61752BOX
ブルージュースゲルローディングバッファー	インビトゲン	10816015
ゲルローディングのヒント	VWRの	53509から015
タンパク質分子量標準	インビトゲン	LC5800
Novex Tris-Glycine-SDSランニングバッファー	インビトゲン	LC2675
Novexザイモグラム再生バッファー	インビトゲン	LC2670
Novexザイモグラム現像バッファー	インビトゲン	LC2671
SimplyBlueセーフステイン	インビトゲン	LC6060

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