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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. 抗原標識ミクロスフェアの調製
- 固有のビーズ領域を持つ磁性ミクロスフェアの3つの異なるバイアルを選択し、使用した各バイアルのビーズIDとロット情報を記録します。
手記：次の手順は、個別のマイクロスフェア領域ごとに実行されます。ミクロスフェアは光に敏感であり、光に長時間さらされないように保護する必要があります。洗濯中は、ミクロスフェアを乱さないように注意してください。邪魔な場合は、2回目の60秒の間隔を空けてください。
- マイクロスフィアストックを60秒間ボルテックスし、使用前に5分間超音波処理して凝集したビーズを解離します。
- 1.0 x 106ビーズを1.5 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。
- チューブを磁気セパレーターに挿入し、60秒間分離します。チューブを磁気セパレーターに入れたまま、ビーズペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
- チューブをマグネティックセパレーターから取り外し、ビーズを100μLのHPLCグレードの水で再懸濁し、30秒間ボルテックスします。チューブをマグネティックセパレーターに60秒間戻し、続いて上清を取り除きます。この洗浄プロトコルを2回繰り返します。
- チューブをマグネティックセパレーターから取り外し、洗浄したマイクロスフェアを90 μLの100 mM Monobasic Sodium Phosphate, pH 6.2(Activation Buffer)にボルテックスで30秒間再懸濁します。
- 10 μL の 50 mg/mL Sulfo-NHS (活性化バッファーで希釈) をマイクロスフェアに加え、10 秒間穏やかにボルテックスします。10 μL の 50 mg/mL EDC 溶液 (活性化バッファーで希釈) を加え、10 秒間穏やかにボルテックスします。室温 (RT) で 20 分間、10 分ごとに穏やかなボルテックスでミクロスフェアをインキュベートします。
- LC/MSグレードの水の代わりに、50 mM MES、pH 5.0(カップリングバッファー)を使用して、洗浄ステップ1.4〜1.5を繰り返し、合計2回の洗浄を行います。
- チューブをマグネティックセパレーターから取り外し、ビーズを100 μLのカップリングバッファーでボルテックスで30秒間再懸濁し、その後すぐに必要な量のタンパク質を添加します。
- カップリングバッファーで総容量を150μLにします。カップリング反応をボルテックスで30秒間混合し、RT.
での回転により2時間インキュベートします
手記：本明細書で定義されるアッセイでは、標識を以下のタンパク質濃度で行いました:Spike S1:5μg;ヌクレオカプシド:5μg;メンブレン:12.5μg。
- LC/MSグレードの水の代わりにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)-1%ヤギ血清アルブミン、0.01%ポリソルベート-20(クエンチバッファー)を使用して、ステップ1.4を繰り返し、合計2回の洗浄を行います。洗浄したマイクロスフェアを、0.05%アジ化ナトリウムを含む100 μLのクエンチバッファーにボルテックスで30 s.
再懸濁します。
手記：他の手順に進む前に、ビーズを少なくとも6時間完全に急冷させます。
- 自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して、回収されたマイクロスフェアの数をカウントします。観察されたビード濃度を記録します。
- 結合したマイクロスフィアを暗所で4°Cで冷蔵します。
2. 手続き
- アッセイ性能(基本プロトコール)
- 結合したミクロスフェアを渦で30秒間再懸濁し、~60〜90秒間超音波処理します。
- 各ビーズコロイドを必要な量をそれぞれのチューブから取り出し、ビーズコロイドを新しい1.5 mL微量遠心チューブに組み合わせます。
- チューブを磁気セパレーターに挿入し、60秒間分離します。チューブを磁気セパレーターに入れたまま、ビーズペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
- セパレーターからビーズを取り出し、ビーズを100μLのPBS-1%ウシ血清アルブミン、0.01%ポリソルベート-20(アッセイバッファー)、およびボルテックスで30秒間再懸濁します。チューブを磁気セパレーターに入れ、60秒間分離します。この洗浄プロトコル(つまり、ステップ2.1.3-2.1.4)を2回繰り返します。
- 3プレックス作動マイクロスフェア混合物の濃度を調整するには、適切な量のアッセイバッファーを添加して、各ターゲットの1 μLあたり100マイクロスフェアの最終濃度を生成します。
- ステップ2.1.5で調製したマイクロスフェア混合物12.5μLを384ウェルプレートの各ウェルに、または25μLを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。
- 血漿/血清検体をアッセイバッファーで500倍に希釈します。希望する滴定に従って標準試料を調製します。
- ブランクサンプルとして12.5 μLのアッセイバッファーを添加し、希釈した試料または標準試料をそれぞれ384ウェル試料プレートの指定ウェルに加えるか、25 μLのブランク、希釈試料または標準試料を96ウェル試料プレートの各ウェルに加えます。
- プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、700 rpmに設定したプレートシェーカーでRTで1時間インキュベートします
手記：希釈曲線の概略図を表1に示します。
- ステップ2.1.11で指定されているアッセイバッファーを使用して、抗ヒト検出抗体(二次抗体溶液)の溶液を4 μg/mLで調製します。
- Super Bright 436 (SB)/ヤギ抗ヒト IgA、フィコエリトリン (PE) コンジュゲート検出抗体と結合したヤギ抗ヒト IgM を 4 μg/mL で調製するか、ヤギ抗ヒト IgM、SB コンジュゲート/ヤギ抗ヒト IgG、PE コンジュゲート検出抗体を 4 μg/mL で調製します。
手記：384ウェルプレートフォーマットでは、調製した二次抗体溶液12.5 μL/ウェル、96ウェルプレートフォーマットでは25 μL/ウェルが必要です。
- プレートを磁気セパレーターに置き、すばやく洗浄し、バイオハザード容器を力強くひっくり返して、ウェルから液体を取り除きます。プレートを逆さまにしたまま、プレートを厚い紙の束に強く叩きます。
- 各ウェルを100 μLのAssay Bufferで洗浄し、前述のようにバイオハザード容器上で液体を強制的に反転させて除去します。これらの手順(2.1.12-2.1.13)を繰り返して、合計2回の洗浄を行います。使用済みの紙束はすべてバイオハザード容器に捨てます。
- 12.5 μLの二次抗体ワーキング溶液を384ウェルプレートの各ウェルに、または25 μLを96ウェルプレートの各ウェルに添加します。プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、700 rpmに設定したプレートシェーカーでRTで30分間インキュベー
トします。
- 洗浄手順2.1.12-2.1.13を繰り返します。
- 75 μLのアッセイバッファーを384ウェルプレートの各ウェルに、または100 μLを96ウェルプレートの各ウェルに添加します。プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、700rpmに設定したプレートシェーカーでRTで5分間インキュベー
トします。
- システムマニュアルに従って、機器アナライザーを介して60μLを分析します。
表1:標準曲線の希釈シリーズ:IgG血清型の標準曲線に使用される希釈係数の表;α-Spike S1およびα-Nucleocapsidでは1 μg/mLから、α-Membrane抗体では5 μg/mLから始まる7ポイント、1:5の段階希釈曲線として提示されます。
名
| 標準番号 | 希釈シリーズ | アンチスパイクS1またはN(μg/mL) | 抗膜(μg/mL) |
| 空砲 | 空砲 | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | STD2の1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |