ホスホリパーゼ活性アッセイ:Anthopleura dowii由来の粗毒抽出物中のホスホリパーゼ活性を測定するためのゲル拡散アッセイ

要約

出典: Ramírez-Carreto, S., et al., Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straight Bioassays. J. Vis. Exp. (2022年度)

このビデオでは、海洋イソギンチャクであるAnthopleura dowiiの粗毒抽出物にホスホリパーゼが存在することを確認するためのアッセイを実演しています。このアッセイは、アガロースゲル拡散技術を利用しており、酵素ホスホリパーゼが固体培地に取り込まれたリン脂質を放射状に拡散および分解します。

プロトコル

1. 生物コレクション

1. イソギンチャクを採取する A. dowii.
   注:ここでは、生物はメキシコのカリフォルニア州エンセナダバハ沖の潮間帯で干潮時に収集されました(図1A、B)。 
2. 生物を海水の入った容器に入れて実験室に輸送します(図1C)。
3. 実験室では、蒸留水で生物を手で洗浄し、体に付着している大きな基質粒子を取り除きます。
4. 直ちに生物を-80°Cの超冷凍庫で72時間凍結します。
5. 凍結乾燥条件を-20°C、0.015psi、48時間、凍結乾燥用の特別なガラスに生物を入れます。
6. 凍結乾燥した生物は、使用するまで-20°Cで保管してください。

2. 組織の水分補給

1. 凍結乾燥生物の乾燥重量20 gを、60 mL(1/3 w / v)の50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5、および1つの阻害剤カクテル錠剤で再構成します(材料の表)。
2. マグネチックスターラーで、サンプルを~800rpm、4°Cで12時間連続的に攪拌します。

3. 毒素の放出

1. 細胞溶解と線虫嚢胞の排出を誘導するには、サンプルを-20°Cで12時間凍結し、その後、容器を室温(RT)の水に最大90%まで解凍するまで置きます。この手順を3回繰り返します。
   手記： サンプルは100%解凍されません。タンパク質の分解を防ぐためには、サンプルを~4°Cに維持することが重要です。
2. 排出された線虫嚢胞を共焦点顕微鏡で観察します。スライドにサンプル10μLを載せ、その上にカバースリップを敷きます。共焦点顕微鏡で100倍と60倍の倍率で観察します。ここでは染料は必要ありませんでした。
3. 共焦点顕微鏡で撮影した画像をImageJソフトウェア(バージョン1.53c、Wayne Rasband、国立衛生研究所、米国、https://imagej.nih.gov/ij)で処理します。
4. 線虫嚢胞の内側の尿細管がほどけて外側にある場合、線虫嚢胞は排出されます。次に進みます。それ以外の場合は、もう1回だけ凍結融解サイクルを実行します。
5. 抽出物を清澄化するには、サンプルを 25,400 x g で 40 分間 4°C 遠心分離し、上清を回収して再度遠心分離します。この手順を3〜4回繰り返します。
6. 上清を回収し、ペレットを捨てます。上清または粗抽出物には、毒成分(毒素)と、脂質、炭水化物、核酸などの他の細胞分子が含まれています。

4. 総タンパク質の定量

1. 市販のBradford比色分析アッセイキット(材料表)を使用して、粗抽出物のタンパク質濃度を測定します。
2. 染料試薬(染料1部と蒸留水4部)を希釈します。
3. ウシ血清アルブミン(BSA)フラクションV(材料表)溶液をリン酸緩衝液(50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5)中に1 mg/mL濃度で調製します。
4. 表1にリストされている溶液を3回に分けて調製します。
5. 各溶液をシェーカーで4秒間激しく混合します。
6. サンプルを振とうせずに、室温で5分間インキュベートします。
7. 595nmで吸光度(AU)を測定します。
8. サンプルBSA吸光度の平均(AU対タンパク質濃度)をプロットし、グラフの式(式1)を決定します。
   
   ここで、Yは吸光度、Mは線の傾き、Xはタンパク質濃度、BはY切片です。粗抽出物の濃度を計算するには、次のようにxを解きます:
   

5. ポリペプチド毒の複雑さを判定

する

1. マニュアルに従って、垂直ゲル電気泳動用のガラス容器を組み立てます。
2. アクリルアミドミックス(30%)を調製する:アクリルアミド29.2g、ビスアクリルアミド0.8g、最終容量100mL。0.45 μmのメンブレンを使用して溶液をろ過します。溶液を4°Cの暗いボトルに保管します。次に、分離ゲル用の混合物を調製します(表2)。
3. SDS-PAGEゲルは、レゾリューションゲルとスタッキングゲルから構成されています。表2に定義されている溶液量に従ってゲルを調製します。調製中は、重合時間を短縮するために、各混合物を4°Cに維持するようにしてください><。 手記：各混合物の量は、使用する機器のブランドによって異なります。このプロトコールでは、容量は、垂直電気泳動チャンバー用の厚さ0.75mmの15%アクリルアミドゲルの調製に対応します(材料表)。
4. アクリルアミドが重合した後、~10分間、スタッキングゲルの混合物を加えます。
5. スタッキングゲル用の混合物を準備し、すぐにガラスプレートに加え、コームを置いてサンプルをロードするためのウェルを形成します。
6. スタッキングゲルが重合したら(~15分)、コームを取り外し、ガラス容器をチャンバーに入れて垂直電気泳動します。
7. 200 mLの電極バッファー(0.25 M Tris、0.192 Mグリシン、0.1% SDS)を電気泳動チャンバーに入れます。
8. 粗抽出物の分析:30 μgの粗抽出物を5 μLのタンパク質ローディングバッファー(25%グリセロール、15%ドデシル硫酸ナトリウム、25%2-メルカプトエタノール、0.125 mM Tris pH 7、ブロモフェノールブルー0.1 mg / mL)と混合してタンパク質を変性させます。最終容量は<50μLでなければなりません。
9. 90°Cで5分間加熱し、冷却した後、1,400 x gで3秒間遠心分離します。10.スタッキングゲルのウェルにサンプルをロードします。標準分子量ラダーをロードします。
10. スタッキングゲルのウェルにサンプルをロードします。標準分子量ラダーをロードします。
11. 25 mA 定数で電気泳動を 1 時間 30 分実行します。
12. 電気泳動チャンバーからガラス容器を取り出して、ゲルタンパク質の染色を進めます。

6. タンパク質染色

1. ゲルを50 mLの蒸留水ですすぎ、緩衝電極から破片を取り除きます。
2. 水を捨てます。
3. ゲルタンパク質の拡散を避けるために、固定溶液(エタノール60 mL、酢酸20 mL、蒸留水20 mL、最終容量100 mL)を加えます。80 rpmで振とうしながら、室温で40分間インキュベートします。溶液をデカントします。
4. タンパク質架橋溶液(エタノール15 mL、グルタルアルデヒド0.25 mL、蒸留水50 mL、最終容量65.25 mL)を加え、80 rpmで振とうしながら室温で30分間インキュベートします。解決策を削除します。
5. ゲルを蒸留水100mLで5分間洗浄し、水を取り除きます。この手順を 4 回繰り返します。
6. 50 mLのCoomassie brilliant blue R-250ろ過溶液(40%メタノール、10%酢酸、50%蒸留水、0.1%染料、最終容量100 mL)でタンパク質染色を行い、実験室の回転振動子で室温で60 rpmで15分間撹拌します。
7. 溶液を回収すると、他のゲルの染色に使用できます。
8. 余分な色素を除去するには、脱染液(メタノール40 mL、酢酸10 mL、蒸留水50 mL)を加えます。バンド(染色されたタンパク質)が視覚化されるまで、RTで攪拌(80rpm)を続けます。
9. ゲルを50 mLの蒸留水に保持し、ゲルドキュメンテーションシステムで画像をスキャンします。

7. ホスホリパーゼアッセイ

1. 鶏の卵1個を1%SDSで蒸留水で洗います。
2. 無菌条件下で卵黄を卵白から分離します。
3. 0.86% NaCl溶液50 mLを調製し、0.22 μmフィルターでろ過します。次に、溶液Aを調製します:卵黄12mLと0.86%NaCl溶液36mLを加えます。
4. 調製液B:300 mgのアガロースを50 mLのバッファー(50 mM Tris、pH 7.5)に混合し、0.22 μmフィルターでろ過します。溶液を電子レンジで沸騰するまで加熱します。温水で冷やして43〜45°Cにします。
5. 溶液Cを調製する:10 mM CaCl2を調製し、0.22 μmフィルターでろ過します。
6. 調製液D:10 mgのローダミン6Gを1 mLの蒸留水に添加します。
7. 無菌状態(層流フード)で、溶液Bに500μLの溶液AとCを、溶液Dに100μLを加えて混合し、各ペトリ皿(90×15mm)に25mLを注ぎます。
8. 溶液が無菌条件下で固化するのを待ちます(30分)。
9. 細いチューブでウェル(直径2~3mm)を作ります。
10. 1つのウェルに合計20 μLのリン酸緩衝液(ネガティブコントロール)を、別のウェルに20 μLの測定されたホスホリパーゼ(ポジティブコントロール)を添加します。
11. 異なる量の粗抽出タンパク質(5、15、25、35、45 μg)を残りのウェルに、それぞれ最終容量20 μLに入れます。
12. 寒天がすべてのサンプルを吸着するのを待ちます(30分)。
13. 37°Cで20時間インキュベートします。
14. ウェルの周囲にハローが形成された場合、これはホスホリパーゼ活性を示しています。ノギスで形成されたハローを測定します.
    手記： 実験を 3 回で実行します (7.1 から 7.14 の手順)。

結果

図1:イソギンチャクのコレクション。(A)メキシコ、バハ・カリフォルニア・ノルテ州エル・サウザルの潮間帯。(B)イソギンチャクを採取した。(C)Anthopleura dowii Verrill、1869年。

表1:Bradfordアッセイによるタンパク質の定量。

>チューブ

蒸留水

BSAの

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mLコニカル遠心チューブ	コーニング	430766
2-ブロモフェノールブルー	シグマ	B75808
2-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M6250-100ミリリットル
50 mLコニカル遠心チューブ	コーニング	430828
酢酸氷河	J.T.ベイカー	9515から03
アクリルアミド	プロメガ	V3115
アガロース	プロメガ	V3125
ビサアクリルアミド	プロメガ	V3143
ウシ血清アルブミンフラクションV	シグマ	A3059-100Gの
ブラッドフォードプロテインアッセイ	バイオ・ラッド	5000006
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C3306
細胞培養プレート96ウェル、V底	コーニング	3894
遠心機	エッペンドルフ	5804Rの
遠心分離管	コーニング	CLS430829
ChemiDoc MPシステム	バイオ・ラッド	1708280
クエン酸	シグマ・アルドリッチ	251275
クリアフラットボトム96ウェルプレート	サーモサイエンティフィック	3855
クーマシーブリリアントブルーG-250	バイオ・ラッド	#1610406
クーマシーブリリアントブルーR-250	バイオ・ラッド	1610400
葡萄糖	J.T.ベイカー	1916-01
ダクトレスエンクロージャ	ラブコンコ	垂直	https://imagej.nih.gov/ij イメージJ 1.53c
ジェルドックEZ	バイオラッド		ゲルドキュメンテーションシステム
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5516-4L
血球計算盤	マリエンフェルド	650030
ImageJ (ソフトウェア)	NIH, アメリカ	バージョン 1.53c
インキュベーター211	ラブネット	I5211 DS
メタノール	J.T.ベイカー	9049から03
ミニプロティアンテトラセル	バイオ・ラッド	1658000EDU
Na2HPO4	J.T.ベイカー	3824から01
NaCl	J.T.ベイカー	3624から01
NaH2PO4.H2O	J.T.ベイカー	3818から05
Originソフトウェア		バージョン9	シグモイド調整でプロットを設計するには
ペトリディッシュ	隼	351007
ピペットマンキット	ギルソン	F167380
プレキャストミニゲル	バイオラッド	1658004
染色済みタンパク質ラダー	サーモサイエンティフィック	26620
プロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11836153001
Protein Assay Dye 試薬濃縮物	バイオ・ラッド	5000006
ローダミン6G	シグマ・アルドリッチ	252433
SDSの	シグマ・アルドリッチ	L4509
クエン酸ナトリウム二水和物	JTベイカー	3646-01
分光 光度 計	サーモサイエンティフィック	G10S UV-VISの
トリスベース	シグマ・アルドリッチ	77勝86敗1分
ボルト電源	ヘファー	PS300Bの