リング状マイクロパターニング細胞キラリティアッセイ:リング状マイクロパターン上の細胞アラインメントに基づく多細胞キラリティーを決定するIn vitro技術

要約

出典: Zhang, H. et al. A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、リングマイクロパターンなどの限定された幾何学的境界における細胞のアライメントバイアスを決定するための細胞キラリティアッセイについて説明します。キラリティは、ほとんどの細胞タイプに固有の特性であり、遺伝的要因と環境要因によって決定されます。正常な細胞集団のキラリティーを知ることは、薬物処理された細胞をスクリーニングするのに役立ちます。

プロトコル

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)切手の作製

1. CADソフトウェアを使用して、内径250μm、外径450μmのマイクロスケールリングの配列を描画します。このプロトコルで使用されるパターンは、リング間の距離が850μmの10 x 10アレイです。
2. 微細加工会社のマスク印刷サービスを使用して、パターンの透明マスクを希望の解像度で印刷します(材料の表を参照).
   手記： リングの寸法は、多くの細胞タイプで機能することが証明されています。
3. 所望の特徴を含むマスクを使用して紫外線(UV)フォトリソグラフィーを行い、ネガ型フォトレジストモールド(SU-8など)を作製します。
   1. フォトレジストでスピンコートしたシリコンウェーハを、手順1.1〜1.2で作製した透明マスクで覆います。
   2. UVコンタクトアライナー上で、UV光によりマスクの透明領域の下にフォトレジストを重合します.
      手記： さらに洗浄・開発を進め、希望の機能を持つマスターモールドを製作します。運用上の詳細は、使用する機器によって異なります。
4. PDMSエラストマープレポリマーは、硬化剤と10:1の比率で混合して調製し、混合物をペトリ皿の金型にキャストします。
5. ディッシュを真空チャンバーに30分間置いてPDMS内の気泡を取り除き、60°Cのオーブンで少なくとも2時間焼きます。
6. PDMSを完全に硬化させた後、パターン配列をスタンプにカットします.
   手記： 厚手のスタンプ(約1cm)は、マイクロコンタクト印刷の後期工程での取り扱いの容易さから好ましい場合があります。

2. スライドガラスのコーティング

1. スライドガラスを清掃します。スライドを100%エタノール浴に浸し、5分間超音波処理した後、水ですすいでください。
2. このステップを最初にアセトンで繰り返し、次にイソプロパノールで繰り返し、続いて窒素流で乾燥させます。
3. 電子ビーム(Eビーム)蒸着装置を用いて、スライドガラス上にチタンや金の層をコーティングします
   手記：チタン層の場合、所望の厚さは15 Å(1 Å = 10-10 m)です。金の層の場合、所望の厚さは150 Åです。チタン層が金とスライドガラスの間の接着剤として機能するため、最初にチタンをコーティングし、次に金をコーティングします。
4. 洗浄したスライドを蒸発チャンバーに入れ、シャッターの下に金とチタンのるつぼを挿入します。
5. 金属を溶かす前に、チャンバーをポンプで下げて10-5Pa未満の真空を作り出します。電子ビームを金属に集束させ、成膜厚さの制御に適した成膜速度となるようにパワーを調整します。
6. シャッターを開けて金属蒸着を開始します。希望の厚さに達したらシャッターを閉じます。
7. るつぼを2つの金属の連続蒸発間で切り替えます。
8. るつぼが機器の必要に応じて冷えるのを待ち、チャンバーを通気し、金でコーティングされたスライドガラスを取り出します。
9. 機器のメンテナンスのためにチャンバーを再度ポンプダウンします.
   手記： 運用の詳細は、特定のEビーム蒸発器によって異なる場合があります。チタンの堆積速度を十分に制御し、低くすることが重要です。厚いチタン層は、特に細胞の蛍光イメージングにおいて、しばしば視認性の低下につながります。コーティング後、チタン/金コーティングされたスライドガラスは、室温の乾燥真空チャンバーに少なくとも1か月間保存できます。

3. マイクロコンタクト印刷

1. 必要に応じて、チタン/金でコーティングされたスライドを小さくカットします。一般的な用途では、12 mm x 12 mmの正方形が推奨されます(図1B)。
2. ガラスカッターを使用して表面をスライドさせてへこんだトラックを残し、スライドガラスを両側で保持し、へこんだ部分で曲げて小さな四分の一に分割します。金でコーティングされた表面には触れないでください.
   手記：誤って転倒した場合にガラスのどちら側がコーティングされた表面であるかを視覚的に判断するには、両側の光の反射を比較します。金で覆われた表面は明るく反射しますが、コーティングされていない面は(ガラスの反対側のチタン層から)暗く反射します。別の方法は、スライドのエッジを観察することであり、コーティング面は垂直切断面から決定できます。
3. 少なくとも10分間、軌道シェーカーで金面を上にしてペトリ皿に100%エタノールを浸してスライドをきれいにし、エタノールを吸引し、窒素の流れで吹いて各スライドを乾燥させます。
4. PDMSスタンプを石鹸水で洗浄し、次に100%エタノールで洗浄します。スタンプを窒素ガスで乾かします。
5. 5.74mgのC18粉末を100%エタノール10mLに溶解して、2mMオクタデカンチオール(C18)溶液を調製します
   手記：C18溶液を室温で密封して保管します。C18でパターンをプリントすると、フィブロネクチンと細胞が優先的に結合する粘着性の自己組織化単層が作成されます。
6. PDMSスタンプをC18溶液に浸し、パターン化された表面を下にして10秒間浸し、窒素ガスで60秒間
   で穏やかに乾燥させます 手記：乾燥させるときは、ほとんどの液体が蒸発するまで最初にストリームをスタンプから離して(約1 m)、次にストリームをゆっくりと近づけてスタンプを完全に乾かします。これは、C18溶液がスタンプ上で乾燥するのではなく、吹き飛ばされるのを防ぐためです。
7. stamp 取り外す前に、金のスライドに裏向きを 60 秒間置きます。
8. 適切なスタンピングを確保するには、ピンセットをスタンプにそっとたたいて、パターンを適切に転写します。強く押し下げすぎないでください、そしてピンセットの重量は通常十分です.
   手記：タッピング中のスタンプの目視検査により、スタンプとスライドガラスが均一に接触していることを確認できます。
9. 湿度チャンバーを準備します。
   1. 70%エタノール1mLを逆さペトリ皿の蓋にピペットで入れ、パラフィルムを敷いて表面を覆います(上向きに覆います)。
   2. ピンセットを使用して持ち上げ、気泡が入らないようにパラフィルムを敷き、必要に応じて余分なエタノールを取り除きます。
10. 2 mM HS-(CH2)11-EG3-OH(EG3)溶液を調製する:5 μLのストック溶液を5 mLの100%エタノールに希釈します
    手記： 希釈したEG3溶液は4°Cで密封して保存でき、希釈していないEG3ストックは-20°Cで保存する必要があります。EG3処理は、C18を含まないガラス領域を細胞に接着しないようにするために使用されます。
11. マイクロピペット 40 μL の EG3 液滴を 1/4 ガラススライドごとに湿度チャンバーのパラフィルムに塗布し、液滴間に十分なスペースを残して、ゴールドスライドの間隔を考慮します。
12. ピンセットを使用して、C18プリントされた金のスライドを下向きにして液滴の上に置き、スライドの下に気泡が入らないようにします。蒸発を最小限に抑えるために、スライドを持ち上げずにゆっくりと押し合わせます。
    手記：スライドガラスの一方の端を液滴の近くに置き、次にスライドガラスのもう一方の端をゆっくりと下げます。気泡がある場合は、気泡がなくなるまで金のスライドを持ち上げずに押します。
13. ペトリ皿をパラフィルムでしっかりと密封し、室温で少なくとも3時間放置します
    手記：広範なインキュベーションが必要な場合は、ペトリ皿をダブルシールし、最大24時間放置します。
14. バイオセーフティキャビネットに、金のスライドを上向きにしてペトリ皿に置き、70%エタノールに3回浸してすすぎ、EG3を除去し、エタノールに10分間放置して滅菌します。
15. エタノールを吸引し、滅菌PBSと交換します。
16. ステップ3.9で説明されているように、エタノールの代わりにPBSを使用して別の湿度チャンバーを準備します.
    手記： 表面張力の違いにより、最初に4〜5 mLのPBSを追加してパラフィルムを敷き、気泡を取り除き、余分なものを吸引する方が簡単です。
17. 滅菌PBSで50μg/mLのフィブロネクチン溶液(必要に応じて他のタンパク質)を調製し、マイクロピペットで4分の1ごとに50μLのフィブロネクチン溶液の液滴をパラフィルム上にスライドさせ、液滴の間にいくらかのスペースを残します><。 手記：フィブロネクチンコーティングは、パターン化された表面への細胞接着を促進します。
18. ウェーハピンセットを使用して、スライドを下向きにして液滴の上に置き、スライドの下に気泡が入らないようにします。スライドを持ち上げずにそっと押し合わせます
    手記： スライドの取り扱いには、ガラススライドピンセットまたはまっすぐな幅の広い先端のウェーハピンセットをお勧めします。
19. ペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに30分間放置します。
20. 30分後、3回すすいだ後、金のスライドを上向きにしてPBSに置きます.
    手記：フィブロネクチンパターンのスライドは、4°CのPBSで約1ヶ月間保存できます。

4. マイクロパターン化されたスライドへの細胞の播種

1. 細胞培養培地とトリプシンを37°Cの水浴で温めます.
   手記： 以下の継代培養の説明は、NIH/3T3細胞用です。培養条件は細胞の種類によって異なる場合があります。
2. (オプション)パターン化したスライドを12ウェルプレートの培養培地に浸し、細胞のトリプシン化の前にインキュベーターで37°Cまで温めて、細胞の接着を改善します。
3. 細胞をトリプシン化し、FBS含有培地で中和し、100 x gで3分間遠心分離した後、新鮮な培地とよく混合して再懸濁します
   手記：セルが互いに完全に解離していることを確認してください。
4. 細胞をカウントし、200,000細胞/mLに希釈し、1つのゴールドスライドを含む各ウェルに0.5 mLの細胞懸濁液を加えます。
5. ウェルプレートを数回静かに振って均一な細胞播種を行い、インキュベーターに15分間保存して細胞が付着できるようにします。
6. 15分後、顕微鏡で細胞の付着を確認します。必要に応じて、追加の時間を確保してください。
   手記： 付着した細胞は、目に見えるフィロポディウムまたは平坦化して表面に広がり、ウェルプレートを軽くたたいたり動かしたりしても表面から移動しません。
7. 各ウェルから未接着細胞を含む培地を吸引し、1 mLの培養培地を加えます。薬物治療の場合は、このステップで培地に追加の試薬を補充します。
8. インキュベーターで細胞を24時間培養し、コンフルエンシーをチェックしてキラリティーが形成されているかどうかを判断します
   手記：ほとんどの細胞タイプでは75%を超えるコンフルエンシーが推奨され、過度のコンフルエンシーはキラリティの特性評価に影響を与える可能性があります。

5. 画像コレクション

1. 細胞をコンフルエントに固定します。
   1. ウェルプレートから培地を取り出し、PBSで一度すすいでください。
   2. 4%パラホルムアルデヒド溶液を添加し、室温で15分間インキュベートした後、PBS.
      で3回すすぎます。 注:固定によって細胞の形態が大幅に変化する場合は、固定前のイメージングをお勧めします
2. カメラ機能を備えた位相差顕微鏡を使用して、スライド上の各リングを高解像度で画像化します(分析には10倍の対物レンズで十分です)。

>6. 細胞のキラリティ特性評価(図2)

1. キラリティ特性評価のための MATLAB コード ファイルをダウンロードします。
2. code フォルダーとサブフォルダー (内部に円形の統計ツールボックスがあります) を MATLAB パスに追加し、"ROI_selection.m" ファイルを開きます。4行目で、ディレクトリを目的のデータフォルダに変更します(Windowsユーザーの場合は、4行目と5行目で「/」を「\」に切り替えてください)。
3. 14 行目で画像サイズを変更します。最初の 2 つの図はリングの内側の円のサイズを表し、他の 2 つの図は外側を表します。
   手記： 分析するフォルダー内のすべての画像のサイズが同じであることを確認してください。
4. [実行] ボタンをクリックして MATLAB コード "ROI_selection.m" を実行し、位相コントラスト画像の関心領域 (ROI) を決定します。
5. 選択の正方形を手動でドラッグしてリングに合わせ、画像をダブルクリックして選択を確定します。
6. フォルダ内のすべての画像に対してこの手順を繰り返します(前の画像のROI選択を確認した後、次の画像が自動的にポップアップします)。各画像のROI情報を保存するための「.mat」ファイルが生成されます。
7. 「Analysis_batch.m」ファイルを開き、手順6.2と同様にフォルダのディレクトリを変更します(Windowsをお使いの方は、初めて使用する場合は、5行目、6行目、124行目、130行目で「/」を「\」に切り替えてください)
8. 「Run」ボタンをクリックしてコード「Analysis_batch.m」を実行し、複数のセルラーリングパターンのキラリティを判断します。「datatoexcel.txt」ファイルが生成され、各リングの循環統計と、時計回り、非カイラル、反時計回りのリングの数が含まれます。

結果

図 1.細胞マイクロパターニングの概略図。(A)細胞パターニングのための微細加工およびマイクロコンタクト印刷の手順。フォトレジストを紫外(UV)架橋し、マイクロパターニング機能を有するマスクを介してネガ型フォトレジストを作製した(1-2)。ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマープレポリマーを金型にキャストしてスタンプを作成しました(3-4)。次に、接着性の自己組織化単分子膜(SAM)であるオクタ-デカンチオール(C18)をスタンプにコーティングし、マイクロコンタクト印刷により金コーティングされたスライドガラスに転写し(5-7)、続いて非粘着性のエチレングリコール末端SAM、HS-(CH2)11-EG3(EG3)(8)、およびフィブロネクチン(9)をコーティングしました。次いで、パターンに付着するように細胞を播種した(10)。(B)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
200プルーフエタノール	コプテック	DSP-MD-43
BZX顕微鏡システム	キーエンス	BZX-600
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、高グルコース	ギブコ	11965092
電子ビーム蒸着器	テムスカル	BJD-1800	金チタンフィルムコーティング
ウシ胎児血清	VWRの	89510から186
ウシ血漿由来のフィブロネクチン	シグマ	F1141-5MG
ガラス顕微鏡スライド	VWRの	〒10024-048
ガラスピンセット	エクセルタ	390BSAPIの
金蒸発ペレット	国際先端材料	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH(EG3)	プロキミア	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	数学	MATLAB_R2020b
NIH/3T3細胞	ATCCの	CRL-1658
OAIコンタクトアライナー	OAIの	200	UVフォトリソグラフィー
オクタデカンチオール(C18)	シグマ	オー1858-25ML
オービタルシェーカー	VWRの	〒89032-088
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	研究製品 国際	P32080-100T
ポリジメチルシロキサンシルガード184	ダウコーニング	DC4019862
シリコンウエハ	大学ウェーハ	品番#809
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360-070
SU-8 3050 フォトレジスト	マイクロケム	Y311075 0500L1GL
チタン蒸着ペレット	国際先端材料	TI14
透明マスク(機能付き)	Outputicity.com	該当なし	マスク印刷サービス
トリプシン-EDTA(0.25%)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25200-072

の シリーズ の 名