細胞外小胞取り込みアッセイ:3D蛍光イメージング技術を使用して細胞外小胞の細胞取り込みを可視化および定量化する方法

Abstract

出典: Kim, C. J., et al., Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオでは、細胞外小胞またはEVの細胞内取り込みを視覚化し定量化するアッセイを実演します。このアッセイは、共焦点顕微鏡を用いた3D蛍光イメージングを利用し、細胞表面に付着したEVと内在するEVを区別することができます。

Protocol

1. EVの分離とオンチップ免疫蛍光EVのラベリング

1. 細胞培養培地(CCM)の収集とEV分離のためのCCMの前処理
   1. PC3細胞を75 cm²細胞培養フラスコで30%コンフルエントに播種します。標準培地および細胞株特異的サプリメントでコントロール細胞を90%コンフルエント(~48時間)まで増殖させます.
      手記：EV含有成分(すなわち、ウシ胎児血清)が細胞の取り込みに影響を与えるのを防ぐために、エキソソームが枯渇した培地とサプリメントを使用してください。
   2. CCMを収穫します。
   3. CCMを1000 x gで室温(RT)で10分間遠心分離し、培地で回収された未付着の細胞や大きな破片をペレット化します。上清を新しい円錐管に移します。
   4. 新しいチューブで、上清を10,000 x gで4°Cで20分間遠心分離し、培地に残っている小さな破片とアポトーシス体をペレット化します。大型のEVの中には、ペレットを出すものもあります。上清を新しいチューブに移します。
   5. 0.45 μmの親水性ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンシリンジフィルターで上清をろ過します.
      手記：EVアイソレーションのためにCCMをすぐに処理しない場合は、アイソレーションが実行されるまで、前処理したCCMを-80°Cで保存します。凍結している場合は、凍結融解サイクルを1回に制限します。
2. ナノろ過ベースのマイクロ流体デバイスを使用したCCMからのEV分離
   1. 凍結した場合は、ステップ1.2.2の前にCCMとボルテックスを30秒間完全に解凍します。
   2. 1 mLのプレプロセスCCM(ステップ1.1)をナノろ過ベースのマイクロ流体デバイスのサンプルチャンバーに注入します(材料の表を参照)
      手記：ナノろ過ベースのマイクロ流体デバイスの標準的な操作手順に従ってください。
   3. ベンチトップスピニングマシン(材料表を参照)で3000rpmで10分間回転し、マイクロ流体デバイスを操作します
      手記：最初の分析後にCCMがサンプルチャンバーに残っている場合は、すべてのCCMがサンプルチャンバーから空になるまで追加のスピンを実行します。
   4. ピペッティングで廃棄物チャンバーから液体を取り出し、手順1.2.1、1.2.2、および1.2.3を2回繰り返します
      手記：合計で 3 mL の CCM が EV 分離のために処理されます。
   5. 1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をサンプルチャンバーに注入して、単離されたEVを洗浄します。ステップ1.2.3で述べたように、マイクロ流体デバイスを操作するためのベンチトップスピニングマシンでスピンします。デバイスのメンブレンに純粋なEVを見つけます.
      手記：具体的には、ナノろ過ベースのマイクロ流体デバイスから分離されたEVの品質は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、構造化照明顕微鏡、酵素結合免疫吸着アッセイ、およびリアルタイムPCRによって、従来のUC法と比較されました。
3. ナノフィルターベースのマイクロ流体デバイスを用いたEVの免疫蛍光標識(図1)
   1. アッセイの目的に応じてEV特異的抗体を選択してください（材料表参照）
      手記：特定の抗体は、EV取り込み経路に特異的なリガンド結合部位を妨害する可能性があります(すなわち、エンドサイトーシス)。
   2. 100 μLの単離されたEVを含むデバイスの溶出孔に、1 μg/mLのEV特異的抗体を注入します。
   3. プレートシェーカー上でRTで暗所で1時間インキュベートし、サンプル全体に抗体が均一に分布するようにします。
   4. 溶出穴に粘着テープを貼り付けます。1 mLのPBSをサンプルチャンバーに注入して、残留抗体を洗い流します。
   5. サンプルチャンバーが空になるまで、デバイスを3000rpmで回転させます。ピペッティングで廃棄物チャンバーから液体を取り除きます。1 mL PBSをサンプルチャンバーに注入します
      手記：蛍光標識されたEVは、メンブレンチャンバーに配置されます。
   6. 蛍光標識されたEV(図2)をメンブレンチャンバーから琥珀色のチューブにピペットで移します。使用するまで光を遮断します。

2. 蛍光標識されたEVによる細胞のインキュベーションとEV取り込みアッセイ

1. 細胞培養に適した皿で細胞を播種し、培養します。
   1. 1 x 10⁴ PC3 細胞を 0.2 mL の培地を入れたマイクロスライド 8 ウェルプレート (各ウェル 9.4 x 10.7 mm) に播種するか、4 x 10⁴ PC3 細胞を 1 mL の培地が入った 35 mm ディッシュに播種します。薄いカバースリップ(厚さ0.18mm)からなる細胞培養適合皿に細胞をプレートします
      手記：薄いカバースリップは、光の悪影響散乱を最小限に抑えます。
   2. 最適な細胞培養条件(37°C、5%_CO2濃度、90%湿度)で細胞を一晩接着させます。
   3. 接着した細胞をエキソソーム枯渇培地で2回洗浄します(ステップ1.1.1で説明)。
2. 蛍光標識されたEVによる細胞インキュベーション。
   1. ナノ粒子追跡分析により、蛍光標識されたEVの濃度(ステップ1.3.5)を測定します(NTA、図3)。蛍光標識されたEVを培養細胞に添加する最適な濃度を決定します(ステップ2.1.2)。
   2. 蛍光標識したEVをエキソソーム除去培地で希釈し、ステップ2.2.1で測定した所望の濃度に一致させます。(すなわち、200μLのエキソソーム枯渇培地中の7.80 x 10⁹ EV(NTA値))
   3. 希釈したEVを、2.1.2で調製した接着標的細胞に添加します(ステップ2.2.2)。実験時間(4時間、8時間、または12時間)でインキュベートします。
   4. 細胞をエキソソームフリー培地で3回洗浄し、非内在化EVを除去します
      手記：オプション:細胞は洗浄後に固定できます。
   5. 接着した細胞の細胞質を1 μg/mLのCMTMR((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamine)(材料表を参照)で標識し、最適な細胞培養条件(37°C、5%_CO2濃度、90%湿度)でインキュベートします
      手記：細胞領域色素は、EV取り込みアッセイ中にスパイクされたEVの空間的位置(内部化または表面)を決定するのを助けるために、標識されたEVとは別に蛍光を発する必要があります。
   6. 標識細胞をエキソソーム除去培地で2回洗浄し、残留色素を除去します。新鮮なエキソソーム枯渇培地を細胞に加えて、生細胞共焦点イメージングの準備をします。

3. 共焦点顕微鏡

1. 生細胞イメージングを行うには、ステージ上のインキュベーターを使用して、最適な細胞培養条件(37°C、5%_CO2濃度、90%湿度)を維持します。
2. 調製した細胞をステージ上のインキュベーターに入れます。
3. コントロールサンプルに基づいてイメージングパラメータを設定します.
   手記：推奨されるコントロールサンプルには、蛍光標識されたEVのみ、蛍光標識された細胞、非標識EV、および標識されていない細胞が含まれます。
4. ターゲット細胞の深さとz方向のスタッキングサイズの範囲を決定して、3D共焦点画像を取得します.
   手記：Zスタックの厚さは1μmです。共焦点3D画像取得は2分34秒続きました(各Z平面画像取得には約8秒、合計20枚のZスタック画像が必要でした)。
5. 画像取得は、細胞特異的色素(赤)とEV特異的色素(緑)の両方を同時に複数のzスタック画像に設定します(図4および図5A)。

4. 画像処理

1. 自動画像処理ソフトウェアを使用して、生のzスタック共焦点画像を分析し、細胞によるEV取り込みを決定します(資料表を参照)。
2. 閾値パラメータを細胞およびEV特異的色素の蛍光シグナルに設定します。セルの仮想サーフェスを作成します(図5A、B)。
   1. セルの仮想サーフェスを作成するには、[新しいサーフェスを追加]ボタンをクリックします。
   2. 「アルゴリズム設定」として「最短距離計算」を選択して、ソフトウェアが提供するアルゴリズムを使用し、「次へ:ソースチャネル」をクリックします。
   3. この実験では、チャネル 2 - CMTMR を [ソース チャネル] として選択します。
   4. [スムーズ]を選択し、サーフェススムージングの[サーフェス詳細]に適切な値を入力します。
      注:1ピクセルが生のイメージングデータで0.57μmを表すため、この実験では0.57μmです。
   5. [絶対強度] で [しきい値処理] を選択します。
   6. 提供されたアルゴリズムによって蛍光画像を自動的にしきい値にするには、[しきい値(絶対強度)]をクリックします:値が自動的に設定されます。
   7. 「Split touching Objects (Region Growing)」として「Enable」を選択し、この実験では推定セルサイズの値を「Seed Points Diameter」の10.0 μmに入れます。次に、[次へ: シード ポイントのフィルタリング] をクリックします。
   8. 仮想セルの表面を構成するには、[+ Add] ボタンをクリックし、[Filter Type] として [Quality] を選択します。目視検査による下限の適切な値 (この実験では 210) と上限の最大値 (1485) を [Threshold] に設定し、[Finish] ボタンをクリックします。
      手記：目視検査とは、研究者が生の蛍光画像から細胞領域を識別できることを意味します。
   9. 次に、EVの仮想ドットを作成するには、[新しいスポットを追加]ボタンをクリックします。
   10. 「アルゴリズム設定」として「異なるスポットサイズ(成長する領域)」と「最短距離の計算」を選択し、「次へ:ソースチャネル」をクリックします。
   11. このテストでは、チャンネル1 - Alexa Fluor 488を「ソースチャンネル」として選択します。
   12. スポット検出の「推定XY直径」に適切な値(この実験では1μm)を入力します。次に、[次へ: スポットのフィルタリング] をクリックします。
   13. 仮想 EV ドットを設定するには、[+ 追加] ボタンをクリックし、[フィルターの種類] として [品質] を選択し、目視検査で [下限しきい値] を設定します (この実験では 100)。次に、[Next: Spot Region Type] ボタンをクリックします。
   14. 「絶対強度」として「スポット領域タイプ」を選択し、「次へ:スポット領域」をクリックします。
   15. 閾値とは、EVドットの領域を、目視検査により「Region Threshold」に適切な値を入れ、この実験では「Region Threshold」として100を入れます
       手記：目視検査とは、研究者が生の蛍光画像からEVの領域を識別できることを意味します。
   16. 「領域ボリューム」として「直径開始」を選択し、「終了」をクリックします。
3. ソフトウェアが提供するアルゴリズムを使用して、ステップ4.2で構築面内のグループ化されたスポットを分割します(図5C、i-iv)。
   1. ビルドされたスポットをクリックし、フィルターに移動します。
   2. [+ 追加] ボタンをクリックし、[フィルター タイプ] として [サーフェスへの最短距離] サーフェス = Surface 1 を選択し、[選択を新しいスポットに複製] ボタンをクリックします。下限の最小しきい値 (この実験では -7.0) と上限の最小しきい値 (-0.5)
      手記：スポットの推定半径で上限を設定します。この実験では、ステップ4.2.11でスポット、すなわちEVドットの推定直径を1μmに設定しました。したがって、上限は 0.5 にすることができます。
4. セル内の EV の自動カウント
   手記：ソフトウェアは、セル内のEVの数を自動的にカウントし、ターゲットセルによって内部化された数を示します。
   1. [サーフェスへの最短距離サーフェス = -7.00 から -0.500 の間のサーフェス 1]という、ビルドされたスポット 1 の選択をクリックします。
   2. 統計に移動し、「スポットの総数」から値をエクスポートします
      手記：ソフトウェアが提供するアルゴリズムは、セルの数と体積を自動的に計算します。
5. 上記の計算値に基づいて、インキュベーション期間あたりのEV取り込みの収量を決定します(図6)。
   1. セルの数を取得するには、構築された [Surfaces 1] をクリックし、[Statistics] に移動して、[Overall] から [Total Number of Surfaces] の値をエクスポートします。
   2. 「Detailed」から「Statistics」に移動して、「Detailed」からボリュームをエクスポートします。

Results

図1:ナノろ過ベースのマイクロ流体デバイスを使用したEVの分離とオンチップラベリングの概略図。 (B)EVのオンチップ免疫蛍光標識。(C)非結合抗体の除去。

図2:蛍光標識されたEVのイメージング。蛍光標識(抗CD63-Alexa Fluor 488)EVは、共焦点顕微鏡(40倍対物レンズ)を使用して検出しました。(A)陽性サンプル...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 抗ヒト CD63 抗体	バイオレジェンド	353038	蛍光色素標識EV特異的抗体
CellTracker オレンジCMTMR色素	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C2927	生細胞(細胞質)蛍光標識試薬
CFI アポ ラムダ S 40XC WI	ニコン	MRD77400	共焦点イメージングの対物レンズ、NA=1.25
CFIプランアポVC 20X	ニコン	MRD70200	共焦点イメージングの対物レンズ、NA=0.75
エグゾディスク	Labspinner株式会社	EX-D1001	ナノフィルターをベースとしたEVアイソレーション用マイクロ流体デバイス
エクソディスカバリー	Labspinner株式会社	EX-R1001	エグゾディスクの操作装置
エクソソーム枯渇FBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A2720801	PC3細胞株由来EVコレクション用細胞培養培地の栄養分
ウシ胎児血清(FBS)	VWRの	1500〜500	細胞培養用栄養素
ヤギ抗マウスIgG H&Lプレ吸着剤	アブカム	AB7063	EV標識のネガティブコントロールのためのマウスIgG抗体
イビディ USA U DISH μ-Dish 35 mm	イビディ	81156	共焦点イメージング用の培養皿
イマリス 9.7.1	オックスフォード・インストゥルメンツ	9.7.1	ポストイメージ処理ソフトウェア
インキュベーターシステム+ CO2/O2/N2ガスミキサー	ライブセル機器	TU-O-20	ライブセルイメージング用インキュベーターシステム
ニコン A1 HD25 / A1R HD25 カメラ	ニコン	NAの	共焦点イメージング用カメラ
ニコンエクリプスTi顕微鏡	ニコン	NAの	共焦点イメージング用の倒立顕微鏡
NISエレメント AR 4.50.00	ニコン	40000年50月	ニコン顕微鏡用画像処理ソフトウェア
NTA、NanoSight NS500	マルバーン・パンタリティーナリー	NS500	EV濃度測定装置
OriginPro 2020 (英語	オリジンラボ	9.7.0.185	グラフ作成ソフトウェア
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	細胞培養用抗生物質
RPMIの1640	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21875034	PC3細胞株培養用細胞培養培地
SYTO RNASelect Green 蛍光細胞染色試薬 - DMSO 中の 5 mM 溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S32703	EV標識用蛍光色素のRNA染色