ウイルス様粒子捕捉アッセイ:中和抗体標識磁気ビーズを用いて試料から抗原表示VLPを単離する方法

要約

出典:Rosengarten, J. F., et al. Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、サンプルから抗原を表示するウイルス様粒子(VLP)を単離する、VLPキャプチャーアッセイと呼ばれる免疫沈降アッセイのデモを行います。この抗原は、磁気ビーズに結合した特異的抗体と結合し、固定化された抗原-抗体複合体を形成し、後で分離してさらなる分析のために保存します。

プロトコル

1. サンプル調製

1. HIV構造遺伝子を単独で発現する293-F細胞由来のVLP産生浮遊細胞株を、0.5 x 10⁶細胞/mLの低細胞密度で293-F Expression Mediumに播種します。
2. それらを37°Cおよび8%CO₂で3〜4日間、5cmの軌道と毎分135ラウンド(rpm)のシェーカーインキュベーター回転で膨張させます。
3. 100 x gで5分間遠心分離することにより、産生細胞をペレット化し、清澄化した上清をろ過して残留細胞および細胞破片を除去し、0.45 μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンシリンジフィルターを使用して無細胞細胞培養上清(CFSN)を得ます
   注:プロトコルはここで一時停止できます。CFSNは4°Cで一晩保存できます。
4. 実験にはCFSNを直接使用するか、超遠心分離(112,700 x g、4°C、1.5時間)を使用して35 mLのCFSNからVLPをペレット
化します。
5. 超遠心分離後、上清を捨て、VLPペレットを遠心分離チューブあたり15%(w / v)トレハロース溶液200μLに懸濁します
   注:VLPペレットは、多くの場合、肉眼では見えません。ここでプロトコルを一時停止できます。VLPは-80°Cで保存できます。
6. VLPキャプチャーアッセイの前に、ELISAを使用してVLP含有サンプル中のウイルスコアタンパク質濃度を測定します。このステップは、キャプチャーアッセイのインプットを標準化するために重要です。

2. VLPキャプチャーアッセイ

>注: ワークフローの概要を図 1 に示します。

1. ピペッティングで上下させるか、ローテーターで50rpm以上5分間混合して、磁気ビーズを懸濁します。
2. その間に、bNAbsを含む抗体溶液を調製します。各bNAbを10 μg、200 μLの抗体結合および洗浄バッファー(Table of Materialsを参照)に1反応あたり使用してください
   注:抗体量は、bNAbの親和性および使用するVLP上の抗原デコレーション密度によって異なる場合があります。
3. 1反応あたり50 μLの磁気ビーズ溶液(材料表を参照)を使用し、ビーズを1.5 mLの反応チューブに移します。チューブを磁気分離ラックに置きます.
   注:あるいは、各チューブに強力な単一磁石を使用して、ビーズを上清から分離することもできます。
4. ビーズがチューブの壁に集まるまで数分待って、すべてのビーズが集まることを確認します。上清を取り除きます。
5. 磁石を取り外し、ステップ2.2で調製したbNAb溶液200μLにビーズを懸濁します。ローテーター上で室温で50 rpmで30分から3時間インキュベー
トします。
6. 反応チューブを再び磁気分離ラックに入れ、待って上清を取り除きます。
7. チューブを磁石から取り外し、200 μLの抗体結合洗浄バッファーに再懸濁してビーズを洗浄します。
8. 手順2.4を繰り返します。できるだけ多くの洗浄バッファーを取り除きます。
9. ビーズ結合したbNAbs.
   にサンプルを追加します。 注:HIV由来粒子を用いた捕捉アッセイのVLPインプットは、反応ごとに少なくとも15 ngのウイルスコアタンパク質である必要があります。VLPの量は、bNAbの親和性、および使用するVLPの抗原装飾密度によって異なります。
10. ステップ 2.9 で添加したサンプル量が 1 mL 未満の場合は、PBS を添加してサンプル量を 1 mL に調整します。ピペッティングでビーズを静かに吊り下げます。
11. サンプルとビーズをローテーター上で室温で2.5時間インキュベートします。ビーズが懸濁液のままで、インキュベーション中に溶液が完全に混合されていることを確認してください。
12. チューブを磁石の上に置き、上清を取り除きます。
13. 磁気ビーズを200μLの洗浄バッファーに懸濁して洗浄します(材料の表を参照)。洗濯手順を3回繰り返します。
14. ビーズを100 μLの洗浄バッファーに懸濁し、懸濁液を清潔な(耐熱性の)反応チューブに移します。
15. チューブを磁気分離ラック(材料の表を参照)に置き、上清を完全に取り除きます。
16. 手順2.16.1-2.16.2に従って変性したSDS-PAGEサンプルを調製するか、手順2.16.3-2.16.5に従って磁気ビーズからVLPを溶出することにより、変性していないサンプルを調製します。
    1. 変性SDS-PAGEサンプルを調製するには、ビーズを20-80 μLのLaemmli buffer(p55 Gag assayインプット1 ngあたり0.8 μLのLaemmli buffer)に懸濁し、95°Cで5分間インキュベートします。
    2. SDS-PAGEに直接進むか、サンプルを-20°C.
       で保存してください 注意:Laemmli バッファーには、2-メルカプトエタノールとドデシル硫酸ナトリウムが含まれています。保護手袋と目の保護具を着用してください。皮膚、目、衣服との接触を避けてください。蒸気を吸い込まないでください。換気の良い場所、例えばドラフトで作業してください
       注:プロトコルはここで一時停止できます。
    3. あるいは、非変性溶出ステップを実行して、未変性タンパク質構造が保持されたVLPを取得します。
    4. 25 μLの溶出バッファー(ビーズに付属していることが多い)を磁気ビーズに加え、室温で2〜5分間インキュベー
    トします。
    5. ビーズを取り除き、溶出液をきれいなチューブに移します。溶出液はその後のアッセイに使用するか、4°C.
       で保存してください 注:プロトコルはここで一時停止できます。

結果

図1:無細胞上清を用いたVLPキャプチャーアッセイの主要ステップの概略図(1)VLPキャプチャーアッセイは、HIV-1 bNAbsがタンパク質G結合磁気ビーズに結合することから始まります。その間、p55濃度が定義されたVLP溶液を調製します。無細胞培養上清は、p55 Gag VLP、宿主細胞タンパク質、および核酸の混合物で構成されています。(2)bNAbsとVLP溶液に結合した磁気ビーズを1.5mLの反応チューブに移し、その後、回転させてインキュベートします。(3)抗原表示VLPは、bNAbsコーティングされたビーズによって捕捉されます。これらの免疫複合体を宿主細胞由来の汚染物質から分離することは、磁場中で行われます。(4)ピペッティングで上清を除去し、ビーズを...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL 反応チューブ	エッペンドルフ
10倍PBS	ギブコ	70011044
抗体 (bnAbs)	ポリムン・サイエンティック
Dynabeads プロテイン G 免疫沈降キット	invitrogen (サーモフィッシャーサイエンティフィック)	10007D	バッファーと洗浄が含まれています ソリューション
FreeStyle 293-Fセル	invitrogen (サーモフィッシャーサイエンティフィック)	R790-07
FreeStyle 293 エクスプレッション メディウム	invitrogen (サーモフィッシャーサイエンティフィック)	12338026
磁気分離ラック	ニューイングランドバイオラボ	S1509Sの	1.5 mL x 12 または 1.5 mL チューブ x 6
Optima XE-90超遠心分離機	ベックマン・コールター
ポリフッ化ビニリデン(PVDF) シリンジフィルター、0.45 μm	カール・ロス	KC89.1
PVDF トランスファーメンブレン、0.45 μm	カール・ロス	T830.1
クイックタイターHIV p24 ELISA	セルバイオラボ	VPK-108-H
回転子	ハイドルフ	レアックス2
SW28ローター	ベックマン・コールター
サーモミキサー	セルメディア	基本的な
トレハロース二水和物	カール・ロス	8897.2
ウルトラクリア遠心チューブ	ベックマン・コールター	344058