$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 新しいチャンバー設計(図1)
- 新しいデュアルチャンバーセルアナライザープレートを開きます。上部チャンバーを電極で脇に置きます。
- フライス盤を使用して、セルアナライザープレートのU字型のボトムウェルを2mm削り取ります。
- UVキュレーション接着剤を使用して、孔径0.2μmの2cm×7cmのポリエーテルスルホン(PES)メンブレンを削ったウェルの底に貼り付けます。接着剤が完全に硬化し、不活性であることを確認するために、30分間のキュレーション時間を確保します。
- フライス盤を使用して、側面に沿って2つの縦方向のスリット(1.5 mm x 5.6 mm)を切り取り、新しく製造された3番目のチャンバーの尾根にはめ込みます。
- フライス盤を使用して、セルアナライザープレートの全体寸法(72 mm x 18 mm)を再現した3つ目のポリカーボネートチャンバーを作成します(材料表)。
- 深さ4.8 mm、直径4.75 mmのウェルを作成し、Cell Analyzer Plateの16ウェル設計を再現します。これにより、ウェルあたり90μLの容量が可能になります。
- 側面に 2 つの三角形の隆起部を作成し、チャンバーがステップ 1.4 で作成した元のスリットにロックされるようにします。三角形の水平部分は1.5mm、垂直部分は1.4mm、斜辺は2.052mmです。
- 短辺に直径50.8 mm、高さ1.397 mmのノブを作成して、元のプレートのノッチに収まるようにします(図1、中央)。
- 各ウェルに厚さ0.9mmのゴムワッシャーを使用して、密閉されたフィット感を提供します。
2. 細胞培養 (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasts)
- 接着細胞培養物(~70%コンフルエンス)を1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
- 0.05%トリプシン-EDTA溶液を添加して細胞を持ち上げます。
- 血清を含む細胞培養培地でトリプシン溶液を中和し、細胞懸濁液のアリコートを使用して細胞を数えます
手記：特定の細胞培養培地を表1に示します。
3. 患者由来の異種移植片の解離
- 滅菌メスを使用して、新鮮な腫瘍片(1 cm2)を細かいどろどろに切ります。
- 3 mg/mL トリプシンと 2 mg/mL コラゲナーゼを添加した 20 mL の DMEM F12 培地を入れた 50 mL コニカルチューブに入れます。
- サーマルシェーカー(150 RPM)で37°Cで20分間インキュベートします。
- チューブを500 x gで5分間回転させ、上清を取り除きます。
- 20 μL の DMEM F12 + 2% FBS を加えて細胞を洗浄し、300 x g で 5 分間遠心し、上清を除去します。洗濯をさらに2回繰り返します。
- 1 mLのPDX培地(表1)に再懸濁して、細胞をカウントします。
4. 骨髄細胞の抽出
- 骨髄(BM)採取フィルターを25 mLの1x PBS.
で洗い流します。
手記：この研究では、PBSを病院からの使用済みBM収集フィルターに追加して、フィルター内の残りのBMを収集しました。
- 洗い流したBMを、25 mLの密度勾配培地を入れた50 mLの円錐形チューブにゆっくりと加え、層をできるだけ分離するように注意します。
- 800 x gで18°Cで20分間遠心します。
- 遠心分離(脂肪/血漿)後に最上層を吸い上げ、BM細胞を含む密度勾配培地の上の5 mLの白色層を15 mLの円錐管に移します
手記：あるいは、5 mLピペットを中間層(BM)に触れるまで最上層に浸し、ピペットを動かさずに中央層を非常にゆっくりとピペットで排出します。
- 15 mLのコニカルチューブに1x PBS(~10 mL)を充填し、300 x gで15分間遠心します。
- 上澄み液を取り除きます。残った白いペレットがBMです。
- ペレット中に赤血球が観察された場合は、RBC溶解液5mL(材料表)を加え、室温(RT)で5分間放置します。300 x gで5分間遠心し、上清を取り除きます。
- 1x PBSを10 mL加えて細胞を洗浄し、300 x gで5分間遠心し、上清を取り除きます。ペレットが白くなるまでRBC溶解(ステップ4.7)を繰り返します。
5. 細胞の播種と組み立て
- 3つの滅菌チャンバーすべてを組織培養フードに入れます。
- 下部チャンバーの短辺にあるノブを見つけます。ノブが実験者の方を向くように、下部チャンバーの向き
を変えます。
- 90 μLの培地に30,000〜50,000個の細胞を下部チャンバーの各ウェルに加えます。気泡の形成を避けてください。これらは、分泌された因子を提供する間質細胞ですが、上部チャンバーの電極では検出されません。
- 細胞の運動性のポジティブコントロールとして、2つの下部チャンバーウェルで5%ウシ胎児血清添加培地を使用します。0%血清添加培地をネガティブコントロールとして使用します。
- 細胞のある下部チャンバーをフードに10〜15分間置いて落ち着かせます.
手記：このステップは、細胞が接着している場合、または懸濁液中で増殖する場合に推奨されます。
- 下部チャンバーを90°回転させ、下部チャンバーのノブが中央チャンバーのノッチにスライドするように、中央チャンバーを上に置きます。
手記：下部チャンバーのノブと中央チャンバーの青い点は、アセンブリの両端にあります。
- アセンブリの長辺の両側からカチッという音が聞こえるまで、垂直に押し下げます。
- 160 μLの無血清培地を中央のチャンバーのすべてのウェルに加えます。
- ウェルが充填された後にドーム型のメニスカスが見えていることを確認します。そうでない場合は、ピペットのキャリブレーションに基づいて最終的な容量を調整します。気泡の形成を避けてください。
- 電極を下に向けて上部チャンバーを中央チャンバーに置き、中央と上部のチャンバーの青い点が揃うようにします。
- アセンブリの長辺の両側からカチッという音が聞こえるまで、垂直に押し下げます。
- 25-50 μLの無血清培地を上部チャンバーに加えます。
- 組織培養インキュベーターのデュアルパーパスセルアナライザーにアセンブリを取り付け、30分間待ってからバックグラウンドを測定します。
手記：この時間は、アレイを平衡化するために必要であり、上部チャンバーに追加する細胞株の準備に使用できます。
- 背景を測定し(セクション6を参照)、アセンブリを組織培養フードに戻します。
- 100 μLの無血清培地に30,000〜50,000個の細胞を上部チャンバーの各ウェルに加えます。これらは、電極がメンブレン
を正常に通過すると電極が検出する細胞です
手記：最大の反応を得るためには、アッセイを行う前に、無血清培地または低血清培地で6〜18時間細胞を増殖させることをお勧めします。
- アセンブリをボンネットに30分間放置してから、インピーダンス測定用のデュアルパーパスセルアナライザーに取り付けます。
6. 背景とインピーダンスの測定
- アレイをデュアルパーパスセルアナライザー装置のクレードルに置きます。
- セルアナライザーソフトウェアを開き、使用するクレードルを選択します。
- [メッセージ]タブをクリックし、[接続OK]と表示されていることを確認して、アレイがクレードルに適切に配置され、電極がセンサーと適切に位置合わせされていることを確認します。
- [実験ノート] タブをクリックし、実験に関する情報をできるだけ多く入力します。
- 「レイアウト」タブをクリックし、アレイレイアウトの説明を入力します。
- 「Schedule」タブをクリックし、「Steps」メニューから 2 つのステップ (バックグラウンド・ステップ (1 回のスイープ) と 100 回のスイープを含むテスト・ステップ (15 分ごとに 1 回のスイープ、合計 25 時間) を追加します。
- アレイをデュアルパーパスセルアナライザーインキュベーターに30分間置いた後、再生ボタンをクリックしてバックグラウンド測定を開始します。データを保存するフォルダを選択するように求めるウィンドウがポップアップ表示されます。
- バックグラウンド測定が完了したら、アレイをクレードルから取り外し、細胞培養フードに戻します。
- ステップ5.13で説明したように、細胞を上部チャンバーに添加し、細胞が沈殿するまでアセンブリを組織培養フードに30分間保持します。
- アレイをDual Purpose Cell Analyzerに戻し、「Message」タブで「Connections OK」メッセージを確認します。
- 「Play」ボタンをクリックして、インピーダンス測定を開始します。
- [プロット] タブをクリックして、信号の進行状況を監視します。
- 25 時間前にエンドポイントに到達した場合は、[Execute] ドロップダウン メニューから [Abort] ステップをクリックします。
- データをエクスポートするには、グラフを右クリックし、[リスト形式でコピー]を選択してから、データをスプレッドシートに貼り付けます。
手記：データは、セルインデックスまたはデルタセルインデックスとしてエクスポートできます。グラフやレイアウト情報もエクスポート用に選択できます。
>表1:細胞培養培地の組成。 この表は、MDA-MD-231 培地、J2 線維芽細胞培地、DCIS 培地、および PDX 培地の組成を示しています。
の
の
| メディア | 成分 | 濃度/比率 |
| MDA-MD-231 のメディア | DMEM | |
| ウシ胎児血清(FBS) | 10% |
| J2 線維芽細胞培地 | DMEM | |
| ウシ胎児血清(FBS) | 10% |
| DCIS メディア | DMEM F12 | |
| ウマセラム(HS) | 5% |
| 上皮成長因子(EGF) | 20 ng/mL |
| インスリン | 10 μg/mL |
| ヒドロコルチゾン | 0.5 μg/mL |
| コレラ毒素 | 100 ng/mL |
| PDXメディア | DMEM F12 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | 2% |
| ヘープス | 1メートル |
| インスリントランスフェリンセレンエタノールアミン(ITS) | 10 μg/mL |
| ヒドロコルチゾン | 0.5 μg/mL |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | 1 mg/mL |
