クエン酸シンターゼ活性アッセイ:ショウジョウバエ組織ホモジネート中のミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を測定するための比色アッセイ

要約

出典: Wei, P., et al., A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、ショウジョウバエの組織ホモジネートに存在するミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性アッセイを測定するための比色アッセイについて説明しています。

プロトコル

1. D. melanogasterの比色クエン酸合成酵素活性アッセイ

1. 各サンプルにつき成虫のハエを10匹集めます。遺伝子型ごとに少なくとも3倍のサンプルを収集します。
2. 20 mM HEPES(pH = 7.2)、1 mM EDTA、および0.1% triton X-100を含む氷冷抽出バッファーを、各サンプルごとに1.5 mLの試験管に調製します。
3. 麻酔は、麻酔パッド上で_CO2を使用して成虫のハエを麻酔し、目的の組織を分離します。成虫のハエ胸部を分離するには、たとえば、ハエの胸部を一対の鉗子で固定し、次にハサミを使用して胸部と腹部の境界に沿って切断することにより、ハエの腹部を分離します。筋肉のクエン酸シンターゼ活性アッセイのためにハエの胸部を収集します.
   手記：クエン酸シンターゼ活性を正常化するために組織を使用する場合は、このステップで組織の新鮮な重量を決定します。
4. 成虫のハエ胸部10個を直ちに100 μLの氷冷抽出バッファーに移し、氷上の乳棒でホモジナイズします。サンプルを氷冷に保つには、サンプルを氷上で5〜10秒間均質化し、次にサンプルを氷上に5秒間置いて、チューブ内のすべての組織が完全に均質化されるまで繰り返します。
   手記：チューブをテープで固定し、ホモジネートをチェックして、ホモジネートに血栓がないこと、およびチューブ内の組織が完全に均質化されていることを確認します。すべてのサンプル処理は氷上で行う必要があります。
5. タンパク質含有量を測定するために、新しいチューブで均質化された各サンプルを10 μL取ります。タンパク質測定用のサンプルは氷上に保管してください.
   手記：タンパク質サンプルは、後で分析するために凍結して-80°Cで保存できます。タンパク質濃度は、クエン酸シンターゼ活性の正常化のための内部パラメータとして機能します。
6. 残りの各サンプルに400 μLの氷冷抽出バッファーを加えて、総容量を500 μLにします。気泡の形成を避けながら、少なくとも5回ピペッティングしてよく混合します。各反応について、調製したばかりの反応溶液(20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mM DTNB、0.3 mM acetyl CoA、1 mMオキサロ酢酸)150 μLに希釈した細胞溶解物1 μLを加えます。静かにピペッティングして、泡の形成を避けながら、迅速かつ迅速に十分に混合します。412 nmの吸光度を最小10 s.< br />の間隔で412 nmの吸光度を測定できるプレートリーダーを使用して、25°Cで4分間、10〜30秒ごとに412 nmの吸光度を測定します 手記：別の試薬をピペッティングする前にチップを交換し、ウェル内に気泡が形成されないようにしてください。試薬の混合が不完全な場合、測定値にばらつきが生じる可能性があります。クエン酸シンターゼ活性アッセイは、インタクトミトコンドリア質量の定量に使用されるため、サンプルを採取した直後に室温で行う必要があります。反応緩衝液は使用直前に調製し、保存しないでください。
7. 光学密度 (OD)、吸光度 (abs) (Y 軸) 対時間 (分単位) (X 軸) としてデータをプロットします。次に、曲線の線形部分の傾きを計算します。反応速度は
   
   値をサンプルタンパク質濃度で割って、クエン酸シンターゼ活性を正常化します。クエン酸シンターゼ活性は、
   として計算されます。
   手記：サンプルのタンパク質濃度は、タンパク質濃度アッセイキットで測定できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)	シグマ・アルドリッチ	V900477
2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール(TRIZMA塩基)	シグマ・アルドリッチ	V900483
アセチルCoA	シグマ・アルドリッチ	A2181(英語版)
ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(DTNB)	シグマ・アルドリッチ	D8130
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ・アルドリッチ	V900106
オキサロ酢酸	シグマ・アルドリッチ	O4126
ペレット乳棒	サンゴン	F619072
ペレット乳棒モーター	天元	OSE-Y10
プレートリーダー	ビオテック	永劫
プロテインBCAアッセイキット	ビヨタイム	P0010Sの
鋏	WPIの	14124
トリトンX-100	サンゴン	A110694-0100