リソスタフィンベースの酵素保護アッセイ:細胞外細菌の酵素媒介選択的死滅による細胞内黄色ブドウ球菌負荷を定量化するIn Vitro法

要約

出典:Rigaill, J. et al.抗菌化合物の黄色ブドウ球菌の内在化と細胞内有効性を研究するための改良型酵素保護アッセイ。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、A549細胞における黄色ブドウ球菌の内在化を定量化するためのリソスタフィンベースのin vitro酵素保護アッセイを実演しています。このアッセイは、宿主細胞内の細胞内細菌負荷の定性的、定量的、および特性評価研究に役立ちます。

プロトコル

1. 細胞接種

1. まず、A549ヒト上皮細胞を、フェノールレッドを含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)高グルコースで培養し、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。
2. 24ウェルプレートのすべてのウェルを低倍率顕微鏡で観察し、ヒト上皮細胞が健康で期待どおりに成長していることを確認します。
3. 使用済みの細胞培養培地を24ウェルプレートから取り出して廃棄します。
4. フェノールレッドを含まないDMEMで調製した黄色ブドウ球菌の細菌懸濁液500μLを加え、100%コンフルエントセルを各ウェルに接種します。
5. 細胞を36 ± 1 °Cおよび5% CO₂.
   で2時間インキュベートします。 注:試験する条件ごとにプレートの3つのウェルを使用し(トリプリケート)、少なくとも3つの独立した実験を実行することをお勧めします。インキュベーションの遅延は、実験の目的に応じて適応させることができます。

2. 改良型酵素保護アッセイ(iEPA)による細胞内細菌の定量

1. 滅菌水に3.5 mLの2% Triton X-100と3.5 mLのトリプシン-EDTAを含む7 mLの4x溶解バッファーを調製します。
2. リソスタフィンストック溶液をアセテートバッファーに10 mg/mLで調製し、25 μLをクライオバイアルに分注します。-80°Cで最大6か月間保管してください。
3. 25 μLのリソスタフィンストック溶液(10 mg/mL)と225 μLの0.1 M Tris-HClを混合して、250 μLの新鮮なリソスタフィン使用溶液を1 mg/mLで調製します。4°Cで最大48時間保存します。
4. リソスタフィンを添加した6.25 mLの完全感染培地を250 μLのリソスタフィン作業溶液に加えて
調製します。
5. リソスタフィンを添加した250 μLの完全感染培地を各ウェルに加え、プレートを手で回転させてプレートを穏やかに撹拌します。
6. 細胞を5%_CO2で36±1°Cで1時間インキュベートし、リソスタフィンが細胞外細菌を殺傷するようにします。
7. インキュベーション時間の終了時に、20 mg/mLのプロテイナーゼK10 μLを各ウェルに加え、リソスタフィンを不活性化します。
8. 細胞を室温で2分間インキュベートします。
9. 250 μLの4倍溶解バッファーを添加し、浸透圧ショックにより細胞を溶解します。
10. 細胞を36°C±1°Cで10分間インキュベートします。
11. ウェルの底全体でピペッティングを10回上下させて完全に混合し、細胞が完全に溶解および均質化されていることを確認します。
12. 自動スパイラルプラターを使用して、各ウェルの黄色ブドウ球菌の負荷を決定します。
13. 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベー
トします。
14. 翌日、コロニーカウンターでコロニーの数を数え、各ウェルの細胞内黄色ブドウ球菌の負荷を計算します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルプレート	コーニング・ファルコン	353047
A549細胞株	ATCCの	CCL-185
アセテート緩衝液 pH 4.6	フルーカ	31048	20 mM酢酸ナトリウム中の10 mg/mLのリゾストパヒンストック溶液の調製に使用されます。
AMBICIN(組換えリソスタフィン)	アンビ	LSPN-50	凍結乾燥された推奨リソスタフィン。-80°Cで凍結して長期保存してください。
COS - コロンビア寒天 + 5% 羊の血液	ビオメリュー	43049	ブドウ球菌の増殖に適した寒天プレートを代わりに使用できます。
ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム、高グルコース、フェノールレッド	シグマ・アルドリッチ	D6429
ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム フェノールレッドを含まない高グルコース	シグマ・アルドリッチ	D1145
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	D8537
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、MgCl2およびCaCl2、滅菌ろ過	シグマ・アルドリッチ	D8662
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、滅菌ろ過	シグマ・アルドリッチ	D8537
イージースパイラル希釈	インターサイエンス	414000	自動希釈機とスパイラルプラター
ウシ胎児血清	ギブコ	10270-106
プロテイナーゼK、組換え体 20 mg/mL	ユーロビオ	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg、ロット901727
スキャン4000	インターサイエンス	438000	自動コロニーカウンター
滅菌水	オテック	600500
TC20 自動セルカウンター	バイオラッド	1450102	自動セルカウンター
トリス1 M pH 8.0	インビトゲン	AM9855G	0.1 M Tris-HCl中1 mg/mLのリソスタフィンワーキング溶液の調製に使用します。
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T8787
トリプシン - EDTA溶液	シグマ・アルドリッチ	T3924	0.05% ブタトリプシンと 0.02% EDTA ハンクスバランス塩溶液とフェノールレッド
広視野蛍光顕微鏡	ニコン	Ti2