チューブ形成アッセイは、腫瘍細胞の血管活性を評価するために使用されます。
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この記事について
サマリー
要約
過去数十年にわたって、チューブ形成アッセイを使用して成長因子を減らしたマトリゲルは通常、 体外 1-5 の血管内皮細胞の血管形成活性を実証するために採用されています。しかし、最近成長している証拠は、このアッセイは、内皮細胞の血管の動作をテストするために限定されないことが示されている。その代わりに、それはまた、血管の表現型6-8を開発するために腫瘍細胞の数の能力をテストするために使用されています。この機能により、異種移植動物、vasculogenic擬態（VM）9と呼ばれるプロセスで特定された彼らのvasculogenic行動と一致していた。その腫瘍細胞媒介性のVMを証明する証拠の多くがある内皮細胞の血管新生6、10-13の独立した腫瘍の発生に重要な役割を、果たしている。例えば、腫瘍細胞は、悪性黒色腫と神経膠芽腫患者の8、10、11から組織サンプルにおける血液灌流、血管チャネルの形成に関与することが見出された。ここで、我々は、腫瘍細胞のvasculogenic活性の評価に有用なツールとして、この筒状のネットワークのアッセイを説明した。我々はそのようなメラノーマB16F1細胞、神経膠芽腫U87細胞、および乳癌MDA - MB - 435細胞のようないくつかの腫瘍細胞株は、血管の細管を形成することができることを発見、しかし、一部には、結腸癌HCT116細胞などしないでください。さらに、この血管の表現型は、マトリゲル上に播種した細胞数に依存しています。したがって、このアッセイは、血管細胞、腫瘍細胞だけでなく、他の細胞を含む種々の細胞型の血管性をスクリーニングするための強力なユーティリティとして機能することができる。
プロトコル
1。腫瘍細胞のVasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースのチューブ形成アッセイ
- 腫瘍細胞と微小血管内皮細胞の調製：そのようなU87細胞、メラノーマ細胞B16F1、乳癌MDA - MB - 435、および結腸細胞HCT116、脳の腫瘍細胞（10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で増殖させたインビトロジェンからすべての）。内皮細胞株ヒト微小血管内皮細胞（HMVECs）は1μg/ mlのヒドロコルチゾン、1 ng / mlの上皮増殖因子、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したEBM2培地（ロンザ）で培養した。細胞をPBSで3回洗浄し、0.05％トリプシン/ EDTA（Invitrogen）で剥離した。 5分間、2000回転で遠心後、細胞ペレットをPBSで再度洗浄した。その後、ペレット化した細胞を、血球計でカウントした。
- マトリゲルの準備：成長因子-減のアリコートマトリゲル（BDバイオサイエンス）を室温で暖めていた。完全に融解する前に、それを氷上に移し、その液体は、少なくとも10分間氷上で保存した。その後、マトリゲル50μlのマトリゲルが均一に分散させることができる水平レベルで96ウェルプレートに播種し、37℃で30分間インキュベートした。
- チューブの形成：細胞は（1〜2 × 10 4）内皮細胞の腫瘍細胞やEBM - 2の無血清DMEMに再懸濁し、およびマトリゲルの先頭にロードされました。このア....
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ディスカッション
成功するために、このアッセイのためには、マトリゲルの品質は、最初にテストする必要があります。小さなサンプルがHMVECsを使用してアッセイを事前に実行するためのバイオサイエンスBDから得ることができる。別のバッチの製品には、いくつかの多くは管腔形成のための最適な条件を提供しないような異なる資質を表示することがあります。マトリゲルのアリコートを96ウェルプレートにロードされたときに気泡が細管形成を混乱させることができるので、第二に、あらゆる気泡が、避けるべきである。小さな気泡が十分に書かれていた場合に、マトリゲルは、すぐに実験中に氷上で保存する元マトリゲル管に戻すことができます。さらに、テストされた細胞は対数増殖期での成長率で維持されるべきである。細胞の低成長を示す任意の培養条件が発生した場合、それらは健康な細胞に置き換える必要があります。減少温度（室温）はチューブの形成に影響を与える可能性があるため、管が固定されていない場合最後に、顕微鏡下で管の解析は1時間を超えるべきではない。全アッセイは、細胞死が誘導された管状構造の混乱を避けるために、24時間以内に終了してください。それは、チューブ形成が細胞移動、細胞間接着、生存、およびアポトーシ.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NCI R01 CA120659（RS）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| DMEM | インビトロジェン | 11995 | |
| FBS | インビトロジェン | 16000-044 | |
| 成長因子を減らしたマトリゲル | バイオサイエンスBD | 47743-720 | |
| EBM2キット | ロンザ | CC - 3156 | |
| ニコンECLIPSEのTS100顕微鏡 | ニコン |
参考文献
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J.
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