$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査
されています
1. 溶液の調製
>注:すべての試薬と溶液は、アイロンを含まないガラス器具または使い捨てプラスチック器具で取り扱い、調製してください。鉄分汚染の危険性があるため、金属製の実験材料(ステンレス製のヘラなど)を試薬や溶液に接触させないでください。再利用可能なガラス器具はアイロンがけされていないことを確認してください。材料を適切な実験用洗剤で30〜60分間洗浄し、脱イオン水ですすぎ、脱イオン水で1:3に希釈した37%硝酸溶液に一晩浸し、脱イオン水で再度すすぎ、乾燥させます。
- 酸混合物:ガラス瓶の37%塩酸82.2mLにトリクロロ酢酸10gを加えてよく溶かし、脱イオン水で最終容量を100mLに調整します。使用前に振ってください。あるいは、組織の消化には37%の塩酸のみを使用してください.
手記：この溶液は、暗褐色のガラス試薬ボトルで保存した場合、少なくとも2ヶ月間安定です
注意：塩酸とトリクロロ酢酸は腐食性があり、濃縮された形態は有毒な酸性蒸気を放出します。酸を取り扱うときは、常に防護服、耐薬品性手袋、化学スプラッシュゴーグルを着用してください。それらを吸い込むのを避け、ドラフトの下では常に酸を扱ってください。
- 飽和酢酸ナトリウム:ガラス瓶内の脱イオン水400mLに228gの無水酢酸ナトリウムを加え、室温で一晩撹拌します。溶液を休ませて1日沈殿させます。降水量が発生しない場合は、少量の酢酸ナトリウムを引き続き追加します。溶液をガラス瓶に保管します。
- 発色剤試薬:1mLの発色剤を調製するには、4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリンジスルホン酸二ナトリウム塩1mgを脱イオン水500μLと濃縮(100%)チオグリコール酸10μLに加え、十分に溶解します。最終容量を脱イオン水で1mLにします.
手記：必要なだけ発色剤を調製します。この溶液は、光から保護されている場合、1ヶ月間安定です。
- ワーキングクロモゲン試薬(WCR):5容量の飽和酢酸ナトリウムと5容量の脱イオン水に1容量のChromogen試薬を追加します。
手記：この溶液は、使用日に新たに調製する必要があります。
- 鉄標準液:20 mMの鉄原液を調製するには、5,480 μLの37%塩酸を含む250 mLメスフラスコに111.5 mgのカルボニル鉄粉末を入れます。室温で一晩溶解させます(または沸騰水浴でインキュベートします)。次に、脱イオン水で最終容量100mLに溶液を調製します
手記：標準溶液は、密閉容器に保管すると無期限に保持できます。
- 作業用鉄標準液(WISS):13.5 μLの37%塩酸を500 μLの脱イオン水に加えます。10 μL の鉄標準液を添加し、脱イオン水 (11.169 μg の Fe/mL、200 μM、AAS で測定) で最終容量を 1 mL にします。
手記：作業溶液は、使用日に新たに調製する必要があります。
2. サンプルの乾燥
- メスの刃で10〜100mgの組織のサンプルを切断します。パラフィルムの小片(フレッシュウェイト)に分析/精密天びんを使用して正確に計量します。
- プラスチック製のピンセットを使用して、ティッシュを24ウェルプレート(水分が蒸発できるように蓋を外した状態)に入れ、標準的なインキュベーターで65°Cで48時間乾燥させます。
- あるいは、組織サンプルの乾燥には、実験室のマイクロ波分解オーブンを使用してください。プラスチック製のピンセットを使用して、計量したティッシュペーパーをアイロン不要のテフロンカップに入れ、電子レンジで乾かします。機器の取扱説明書に従って動作パラメータを設定してください.
手記：参考として、特定の分解オーブンを使用して肝臓サンプルを乾燥させるための操作パラメータ(材料の表を参照)を表1に示します。
- プラスチック製のピンセットを使用して、乾燥したティッシュの各片を分析/精密天びん内のパラフィルムの小さな部分の上に置き、正確に計量します(乾燥重量)。
3. サンプル酸性分解
- プラスチック製のピンセットを使用して、乾燥した各組織片を1.5mLの微量遠心チューブに移します。
- 酸混合物1mLを加え、微量遠心チューブを閉じます。組織を省略することを除いて、同様に酸ブランクを準備します.
注意：酸混合物は腐食性であり、有毒な蒸気を放出します。酸混合物を取り扱うときは、保護服、耐薬品性手袋、化学スプラッシュゴーグルを着用してください。息を吸い込むのを避け、常にドラフトの下で取り扱ってください。
- マイクロ遠心チューブをインキュベーター内で65°Cで20時間インキュベートすることにより、組織を消化します。
- 室温まで冷却した後、プラスチック製チップを取り付けたマイクロピペットを使用して、透明(黄色)の酸抽出物(上清)500 μLを新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。透明な上清が得られない場合は、短時間の遠心分離スピンを行います.
注意：上清は強酸性です。上清を取り扱うときは、防護服、耐薬品性手袋、化学スプラッシュゴーグルを着用してください。常にドラフトの下でそれらを取り扱ってください.
手記：この時点で、酸抽出物はすぐに比色分析に使用するか、後で使用するために-20°Cで凍結することができます。凍結したサンプルを室温まで完全に解凍し、ボルテックスしてから使用してください。
4. カラーデベロップメント
- 表2に示されているように、1.5 mLの微量遠心チューブで発色反応を調製するか、またはより高いスループットを得るには、平底の96ウェル透明未処理ポリスチレンマイクロプレートに直接調製します。すべての反応(酸ブランク、標準、およびサンプル)を少なくとも重複して調製します。
- 室温で15分間インキュベートします。
5. 吸光度の読み取り
- 分光光度計またはプレートリーダーで、脱イオン水リファレンスに対して波長535nmのサンプル吸光度を測定します。プレートは蓋を外して読むことも、蓋をしたままでも読むことができます。蓋付きの場合は、測定の直前に蓋から酸蒸気が放出されたために形成された結露を取り除き、吸光度の読み取り値との干渉を防ぎます。
手記：脱イオン水に対して読み取られた酸ブランクの光吸光度(参照)は0.015未満である必要があります。標準物質とサンプルの光吸収率は0.100〜1.000である必要があります。鉄含有量が非常に高いまたは非常に低いサンプルの場合、酸抽出物(上清)とdiH2Oの量を調整する必要がある場合があります(表2):吸光度が1.0より大きい場合は、より小さなサンプル(上清)の量を使用します。吸光度が 0.1 未満の場合は、上清の量を増やします。各サンプルの組織鉄含有量を計算する際には、サンプル量(Vsmp)が考慮されます(ステップ6を参照)。
6. 組織鉄含有量の計算
- 非ヘム組織鉄含有量を次の式で計算します:
組織鉄(μg/g乾燥組織)=式1
AT = 試験サンプルの吸光度
AB = 酸ブランクの吸光度
AS = 標準
の吸光度
Fes = WISSの鉄濃度 (μg Fe/mL)
W = 乾燥組織の重量 (g)
Vsmp = サンプル量 (表 2 の上清の可変量を mL に変換)
Vf = 65 °C での一晩インキュベート後の酸混合物の最終容量 (酸量と乾燥組織量 (mL) に相当、サンプル重量に大きな差がない場合は、1 mL ≈一定量と仮定します)
Vstd = 鉄標準容量 (表 2 の WISS の容量を mL に換算)
Vrv = 最終反応容量(表 2 の総容量を mL に変換)
>表1:ここで使用した電子レンジ消化オーブンでの肝臓乾燥の操作パラメータ
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
| 電力650W(%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 圧力(PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 時間 (分): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| 圧力時間(TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 扇： | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
表2:1.5 mLチューブまたは96ウェルプレートのいずれかでの発色剤反応の調製。
チューブ
名
名
名
円
名
名
名
円
名
円
名
名
名
名
名
名
| | WCR(μL) | 酸混合物(μL) | 上清液(μL) | WISS(μL) | diH2O (μL) | 総容量 (μL) |
| 1.5mL | アシッドブランク | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| 標準 | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| 見本 | 1000 | | 変数 | | 変数 | 1300 |
| 96ウェルマイクロプレート | アシッドブランク | 150 | 22.5 | | | 22.5 | 195 |
| 標準 | 150 | 22.5 | | 22.5 | | 195 |
| 見本 | 150 | | 変数 | | 変数 | 195 |