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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. OC前駆細胞の拡張
- 20 ng/mlのm-CSFを含む完全α-MEM(10%FBS、1%Pen/Strep、1%アムホテリシンB)にPBMCを再懸濁します。PBMCを2.5 x 105細胞/cm2の密度で播種します。通常、15〜20mLの新鮮な血液から単離された細胞は、1つの75cm2フラスコ(1.5〜2×107細胞)に播種することができる。
- 付着した細胞が目的のコンフルエントに達するまで、20 ng/mL M-CSFを含む新鮮な完全α-MEMを3日ごとに細胞に供給します。典型的な収量は、細胞が95%コンフルエントな場合、1.5-2 x106細胞/フラスコです。通常、拡大期間は6日間続きます.
手記：前駆体の破骨細胞形成能は、培養時間が長くなると低下する可能性があります。
2. リン酸カルシウム被覆プレートにおける破骨細胞形成の誘導
- 細胞接着を促進するために、リン酸カルシウム(CaP)コーティングプレートを50 μLのFBSと37°Cインキュベーターで1時間インキュベートします。
- OC前駆体を剥離するには、フラスコをPBSで2回洗浄し、死んだ細胞または非接着細胞を取り除きます。75 cm2フラスコあたり4 mLのトリプシン(材料表)を30分間加えます。.
- 4 mLの完全α-MEMを加えて消化を停止し、セルスクレーパーを使用して細胞を慎重に剥離し、細胞を50 mLチューブに移します。
- ノイバウアーチャンバーなどを使用して、総細胞数を決定します。
- 350 x gで7分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、20 ng/mlのM-CSFおよび20 ng/mLのRANKLを含む十分な完全α-MEMにペレットを再懸濁して、1 x 106細胞/mLの濃度を得る。
- CaPコーティングされた96ウェルプレートからFBS溶液を吸引し、ウェルあたり200μLの細胞懸濁液をピペットで調製します(2 x 105細胞/ウェル)。
- OC前駆体を所望の期間、または実験デザインに関連する所望の試薬とインキュベートします。通常、6日後、および吸収ピットが形成されているときに、多数の大型および多核OCが観察されます。20 ng/mL の M-CSF と 20 ng/mL の RANKL を含む新鮮な完全 α-MEM 培地を 3 日おきに細胞に給餌します。
- インキュベーション終了時に、細胞をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、再度PBSで洗浄します。
- 固定OCは蛍光染色に直接使用するか、4°Cで保存してください。
3. OCsの蛍光染色とリン酸カルシウムコーティング
- 固定細胞を透過化バッファー(0.1% Triton in PBS)で5分間インキュベー
トします。
- アクチンフィラメントを100 μLのAlexaFluor 546標識ファロイジン溶液でPBS中で30分間染色し、染色溶液を吸引します。100 μLのHoechst 33342染色溶液(PBS中10 μg/mL)を10分間添加し、核を染色します。DAPIも使用できます。
- CaPコーティングを100 μLの10 μMカルセインでPBSに10分間染色し、PBSで3回洗浄して画像を撮影します。