培養細胞における基質酸化アッセイ:トラップされたCO2からの放射性シグナルを測定することにより、細胞内の基質酸化を定量化するIn Vitroアッセイ

要約

出典: Song, C. et al., Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with ¹⁴CO₂ Trapping. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオは、¹⁴個のC放射性標識基板を使用して、基板酸化中に放出される_CO2の定量化技術を示しています。放出された¹⁴CO₂をアルカリ溶液に閉じ込め、シンチレーションカウンターで定量化します。異なる基質の酸化は組織間で異なり、組織の病態生理学的状態を反映しています。

プロトコル

放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前承認が必要です。

1. ¹⁴C標識基板の原液調製

1. 11 g の BSA と 33.1 mL のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を混合し、BSA が完全に溶解するまで室温で ~3 時間穏やかに振とうして、4 mM のウシ血清アルブミン (BSA) ストック溶液を調製します。BSAストック溶液を70°Cのウォーターバスで温めてからご使用ください。
2. 50 μCi ¹⁴C-オレイン酸(エタノール中50 μCi/μmol)をバイアルに入れ、蓋を外した状態で指定のRAM作業フードで8時間風乾します。312.5 μL の H₂O を加え、次に 3.5 mg (11.5 μmol) のオレイン酸ナトリウムを加えます。よく混ぜます。
3. 得られた溶液を水浴中で70°Cに温めます。予熱したBSAストック溶液0.9375 mLを添加して、10 mMのホットオレイン酸ストック溶液(¹⁴C-オレイン酸と非標識オレイン酸の比率が1:11.5)を得ます。ストック溶液を分注し、長期間使用するために-20°Cで保存します。
4. 解凍後すぐに¹⁴C-グルコースと¹⁴C-グルタミンを使用します。

結果

図1:CO₂トラッピングアッセイとカルバリア解剖の図。 (A)オレンジ色の破線の三角形で示されているカルバリアの中央領域は、細胞単離のために収穫されます。(B)1.5 mLの微量遠心チューブを_CO2トラップに使用します(ステップ1)。ろ紙(説明のために青い紙)をチューブキャップに収まるようにカットします(ステップ2)。各チューブ内の細胞培養液から400 μLのホットメディアに200 μLの1 M過塩素酸を加え、濾紙に20 μLのNaOHを加え(ステップ3)、蓋を閉めます(ステップ4)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 μmフィルター	シグマ・アルドリッチ	SLGVM33RS	BSA溶液のろ過に使用
0.25%トリプシン-EDTA	ギブコ	25200056	細胞培養からの細胞の解離 プレート
1.5 mL Eppendorf	PR1MA	PR MCT17 RB	反応インキュベーションに使用
10cmプレート	TPPとは	93100	細胞培養に使用
10 mLシリンジ	BDの	302995	long から骨髄を洗い流すために使用されます 骨
10%FBSの	アトランタの生物製剤	S11550	細胞培養培地調製用
14C -グルコース	パーキンエルマー	NEC042X050UC	ホットメディアの作成に使用
14 C-グルタミン	パーキンエルマー	NEC451050UC	ホットメディアの作成に使用
14 C-オレイン酸	パーキンエルマー	NEC317050UC	ホットメディアの作成に使用
23G針	BDの	305120	long から骨髄を洗い流すために使用されます 骨
24ウェルプレート	TPPとは	92024	細胞培養に使用
70 μmセルストレーナー	ミッドシ	70セル	の間に上清をろ過するために使用されます カヴァリアル消化
アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム (AO/PI)染料	ネクセロムバイオサイエンス	CS2の0106	生細胞を染色して seed 密度
ウシ血清アブミン	プロリアントバイオロジカルズ	68700	脂肪酸の結合に使用
セロメーターオート2000	ネクセロムバイオサイエンス		生細胞の数を決定する
遠心機	サーモフィッシャー	レジェンドマイクロ21R	細胞のペレット化に使用
コラゲナーゼII型	ワージントン	LS004176	組織から細胞を解離
カスタムMEMアルファ	ギブコ	商品コード: ME 18459P1	カスタムホットメディアの作成に使用
ダルベッコのリン酸緩衝液 塩田	ギブコ	10010023	試薬の溶解および希釈に使用されます、 そして文化的な皿を洗う
フィルターペーパー	ミリポアシグマ	WHA1001090	水酸化ナトリウムでCO2をトラップ
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7528	カスタムメディアの作成に使用
ヘープス	ギブコ	15630080	細胞培養中にCO2をトラップ
L-カルニチン	シグマ・アルドリッチ	C0283	脂肪酸酸化のためのサプリメント
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G3126	カスタムメディアの作成に使用
MEMアルファ	熱	A10490 (英語)	細胞培養培地
パラフィルム	Pecheney プラスチック包装	PM998	細胞培養皿のシールに使用
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122	細胞培養におけるコンタミネーションを防止
過塩素酸	シグマ・アルドリッチ	244252	代謝中にCO 2を放出 試験
ピルビン 酸	シグマ・アルドリッチ	P5280	カスタムメディアの作成に使用
シンチレーションカウンター	ベックマン・コールター	LS6500	放射能を から測定します。 濾紙
シンチレーション液	MPバイオメディカル	882453	RAMs から放出されるエネルギーを吸収します そしてそれを閃光として再放出
シンチレーションバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03-337-1	シンチレーション用反応容器 流体
炭酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761	ミディアム用バランスバッファー
水酸化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	58045	メタボイルクアッセイ中にCO2をトラップ
オレイン酸ナトリウム	サンタクルス	SC-215879	BSA共役脂肪酸 準備
真空ろ過 1000	TPPとは	99950	フィルター cMEMα

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