培養細胞における基質酸化アッセイ:トラップされたCO2からの放射性シグナルを測定することにより、細胞内の基質酸化を定量化するIn Vitroアッセイ

要約

出典: Song, C. et al., Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with ¹⁴CO₂ Trapping. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオは、¹⁴個のC放射性標識基板を使用して、基板酸化中に放出される_CO2の定量化技術を示しています。放出された¹⁴CO₂をアルカリ溶液に閉じ込め、シンチレーションカウンターで定量化します。異なる基質の酸化は組織間で異なり、組織の病態生理学的状態を反映しています。

プロトコル

放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前承認が必要です。

1. ¹⁴C標識基板の原液調製

1. 11 g の BSA と 33.1 mL のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を混合し、BSA が完全に溶解するまで室温で ~3 時間穏やかに振とうして、4 mM のウシ血清アルブミン (BSA) ストック溶液を調製します。BSAストック溶液を70°Cのウォーターバスで温めてからご使用ください。
2. 50 μCi ¹⁴C-オレイン酸(エタノール中50 μCi/μmol)をバイアルに入れ、蓋を外した状態で指定のRAM作業フードで8時間風乾します。312.5 μL の H₂O を加え、次に 3.5 mg (11.5 μmol) のオレイン酸ナトリウムを加えます。よく混ぜます。
3. 得られた溶液を水浴中で70°Cに温めます。予熱したBSAストック溶液0.9375 mLを添加して、10 mMのホットオレイン酸ストック溶液(¹⁴C-オレイン酸と非標識オレイン酸の比率が1:11.5)を得ます。ストック溶液を分注し、長期間使用するために-20°Cで保存します。
4. 解凍後すぐに¹⁴C-グルコースと¹⁴C-グルタミンを使用します。

2. ¹⁴個のC標識基質を含む培地の調製

>注:メディア内のエネルギー基質の濃度を確実にするために、カスタムメイドのメディアは、使用直前に新鮮な基質を追加して使用する必要があります。ここでは、グルコース、ピルビン酸、グルタミン、フェノールレッド、重炭酸ナトリウムを含まないカスタムメイドのMinimum Essential Medium(MEMα)を使用しています。ただし、最適な培地は細胞タイプごとに決定する必要があります。

1. 8.67gの培地粉末を1Lの精製水に再構成します。2.2 gの重炭酸ナトリウムを加えてpH 7.4にし、0.22 μmの真空ろ過を使用して溶液をろ過します。
2. 新鮮な成分を添加して、最終濃度が5.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸、および10%ウシ胎児血清(FBS)の完全な培地(cMEMα)を得ます。さらに、cMEMαに100 mM L-カルニチンと10 μM HEPESを添加して、脂肪酸の酸化を促進します。
3. 使用直前に、調製したばかりのcMEMαに¹⁴個のC標識基質を添加してホットメディアを作製します。オレイン酸ホットメディウムを作るには、10 mM ホットオレイン酸ストック溶液を cMEMα に添加して、最終濃度 100 μM オレイン酸 (1:100 希釈、最終放射能 0.4 μCi/mL) にします
   手記：1:11.5の比率の高温:低温オレイン酸(ステップ1.3を参照)を含む10 mMの高温オレイン酸ストックを使用して、放射性物質の量を最小限に抑えながら、媒体中の総オレイン酸100 μMの生理学的レベルを達成します。
オ
4. レイン酸ナトリウム2 mLに2 mLのH₂Oを加え、70°Cの水浴で~20分間完全に溶解するまで完全に溶解した後、70°Cに予熱した4 mM BSAストック溶液6 mLとすばやく混合し、10 mMの非標識オレイン酸ストック液を作製します。37°Cの水浴に1時間移し、0.22 μmのフィルターでろ過します。分注して-20°Cで保存し、長期間使用してください。
5. グルコースを高温培地にするには、最終濃度1.333μM(1:4,125希釈、最終放射能0.4μCi / mL)に¹⁴個のC-グルコースを添加します。グルタミンを高温培地にするには、最終濃度の2 μM(1:1,000希釈、最終放射能0.4 μCi / mL)に¹⁴C-グルタミンを加えます。
6. グルコースとグルタミンのホットメディウムに、ステップ2.4の非標識オレイン酸の10 mMストック溶液を添加して、オレイン酸ホットメディウムと同じ最終濃度100 μMオレイン酸を達成します。

3. 細胞の調製

>注:ここでは、カルバリア前骨芽細胞と骨髄マクロファージが例として使用されています。ユーザーは、適切なプロトコルに従って選択した細胞タイプを準備する必要があります。パイロット実験での消化に使用するコラゲナーゼIIの濃度を最適化します。これは、酵素活性がロットによって異なる場合があるためです。

1. 頭蓋骨芽細胞の単離と培養
   1. 生後3-5日目(P3-5)の子犬を斬首して犠牲にし、ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を含む氷冷したDPBSに移します。
   2. 皮膚と軟部組織を取り除いて、頭蓋骨を露出させます。DPBSで周囲の組織を後ろから前に切り取って、中央の領域を収集します(図1A)。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく引っ掻き、その後の消化時に細胞を放出します。
   3. DPBS中のコラゲナーゼII型溶液2 mg/mLおよび4 mg/mL溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22 μmフィルターでろ過します。洗浄したカルバリアを最初に2 mg/mLコラゲナーゼ溶液で15分間消化し、消化溶液を廃棄します。洗浄したサンプルを4 mg/mLコラゲナーゼ溶液で毎回15分間3回分解し、消化溶液をプールして保存します。
   4. 消化溶液を70 μmの細胞ストレーナでろ過し、濾液を300 × gで5分間遠心分離します。10% FBSおよびP/Sを含むcMEMα(ステップ2.2を参照)に細胞ペレットを再懸濁します。
   5. 10 cmプレートに4 × 10⁴細胞/^{cm 2}で細胞をカウントし、播種します。37°Cのインキュベーターで細胞を5%_CO2で3日間培養します。
   6. 細胞を37°Cで0.25%トリプシン-EDTAで解離します。10% FBSおよびP/Sを7.5 ×^{10 5}/cm²で含有するcMEMαを用いた24ウェル細胞培養プレートで細胞をカウントし、播種します。アッセイの前に、細胞タイプごとに少なくとも4つのウェルを播種し、各細胞タイプごとに少なくとも3つのウェルを追加で播種し、アッセイの前に細胞カウントを行います。
   7. 細胞を37°Cで一晩培養してから、基質酸化アッセイを行います。
2. BMMの分離と培養
   注:BMMの培養には、組換えタンパク質として市販できるマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が必要です。M-CSFを発現するように改変された細胞株CMG14-12由来の馴化培地は、ここで使用される経済的な代替品です。
   1. 筋肉と結合組織を切除した後、8週齢のマウスから大腿骨と脛骨を採取します。骨の両端を鋭利なハサミで切って捨てます。
   2. 10% FBS、P/S、および 10% CMG14-12 馴染培地 (BMM medium) を含む 15 mL の cMEMα を含む 23 G 針を取り付けたシリンジを使用して、1 つの大腿骨と 1 つの脛骨から骨髄を 10 cm のシャーレに洗い流します。ペトリ皿内の細胞を37°Cのインキュベーターで5%CO₂で培養します。
   3. 3日後、培地を廃棄し、DPBSですすいでください。付着した細胞を37°Cで0.25%トリプシン-EDTAと5分間解離します。細胞ペレットを遠心分離し、BMM培地に再懸濁します。
   4. 3.1.6で説明したのと同じ方法で、7.5 × 10⁵/cm²の24ウェル細胞培養プレートで細胞をカウントし、播種します。アッセイを開始する前に、BMM培地で37°Cで一晩培養してください。

4._CO2トラップによる基質酸化アッセイ

>注:アッセイ開始前に80〜90%のコンフルエンスを達成するために、各細胞タイプに対して適切な播種密度を決定する必要があります。細胞密度は細胞の代謝状態に影響を与える可能性があることに注意してください。

1. エクストラウェルの細胞をDPBSで2回洗浄します。細胞を0.25%トリプシン-EDTAで解離し、20μLの細胞をDPBSに再懸濁して、20μLのアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)のすぐに使用できる市販の色素溶液と混合します。自動セルカウンターで生細胞の数を決定し、最終計算のためにその数を記録します。
2. アッセイウェル内の細胞をDPBSで2回洗浄します。RAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに500 μLのホットメディウムを加えます。プレートをパラフィルムで密封し、RAM指定のインキュベーターで細胞を37°Cで4時間インキュベー
トします。
3. インキュベーション中に、濾紙を1.5 mLの微量遠心チューブのキャップの内側の領域よりわずかに大きい円形にカットし、紙をキャップにぴったりと挿入します(図1B)。各チューブに200 μLの1 M過塩素酸を加え、キャップの内側に取り付けた濾紙に20 μLの水酸化ナトリウムを加えます。
4. 細胞のインキュベーション後、各ウェルから調製したチューブに400μLの培地を移し、すぐにキャップを閉じます。チューブをチューブラックに室温で1時間放置します。
5. インキュベーション中に、各チューブにシンチレーションバイアルをセットし、4 mLのシンチレーション液を充填します。濾紙の各片をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベー
トします。
6. 組織培養フード、ウォーターバス(¹⁴C-オレイン酸の調製に使用)、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、グランド、およびその他の作業領域で、RAM汚染の可能性についてワイプテストを実施します。ペーパーワイプをシンチレーション液が入ったシンチレーションバイアルに入れます。
7. シンチレーションカウンターを使用して、シンチレーションバイアル内の^14Cの放射能を測定します。読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染してください。

結果

図1:CO₂トラッピングアッセイとカルバリア解剖の図。 (A)オレンジ色の破線の三角形で示されているカルバリアの中央領域は、細胞単離のために収穫されます。(B)1.5 mLの微量遠心チューブを_CO2トラップに使用します(ステップ1)。ろ紙(説明のために青い紙)をチューブキャップに収まるようにカットします(ステップ2)。各チューブ内の細胞培養液から400 μLのホットメディアに200 μLの1 M過塩素酸を加え、濾紙に20 μLのNaOHを加え(ステップ3)、蓋を閉めます(ステップ4)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 μmフィルター	シグマ・アルドリッチ	SLGVM33RS	BSA溶液のろ過に使用
0.25%トリプシン-EDTA	ギブコ	25200056	細胞培養からの細胞の解離 プレート
1.5 mL Eppendorf	PR1MA	PR MCT17 RB	反応インキュベーションに使用
10cmプレート	TPPとは	93100	細胞培養に使用
10 mLシリンジ	BDの	302995	long から骨髄を洗い流すために使用されます 骨
10%FBSの	アトランタの生物製剤	S11550	細胞培養培地調製用
14C -グルコース	パーキンエルマー	NEC042X050UC	ホットメディアの作成に使用
14 C-グルタミン	パーキンエルマー	NEC451050UC	ホットメディアの作成に使用
14 C-オレイン酸	パーキンエルマー	NEC317050UC	ホットメディアの作成に使用
23G針	BDの	305120	long から骨髄を洗い流すために使用されます 骨
24ウェルプレート	TPPとは	92024	細胞培養に使用
70 μmセルストレーナー	ミッドシ	70セル	の間に上清をろ過するために使用されます カヴァリアル消化
アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム (AO/PI)染料	ネクセロムバイオサイエンス	CS2の0106	生細胞を染色して seed 密度
ウシ血清アブミン	プロリアントバイオロジカルズ	68700	脂肪酸の結合に使用
セロメーターオート2000	ネクセロムバイオサイエンス		生細胞の数を決定する
遠心機	サーモフィッシャー	レジェンドマイクロ21R	細胞のペレット化に使用
コラゲナーゼII型	ワージントン	LS004176	組織から細胞を解離
カスタムMEMアルファ	ギブコ	商品コード: ME 18459P1	カスタムホットメディアの作成に使用
ダルベッコのリン酸緩衝液 塩田	ギブコ	10010023	試薬の溶解および希釈に使用されます、 そして文化的な皿を洗う
フィルターペーパー	ミリポアシグマ	WHA1001090	水酸化ナトリウムでCO2をトラップ
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7528	カスタムメディアの作成に使用
ヘープス	ギブコ	15630080	細胞培養中にCO2をトラップ
L-カルニチン	シグマ・アルドリッチ	C0283	脂肪酸酸化のためのサプリメント
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G3126	カスタムメディアの作成に使用
MEMアルファ	熱	A10490 (英語)	細胞培養培地
パラフィルム	Pecheney プラスチック包装	PM998	細胞培養皿のシールに使用
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122	細胞培養におけるコンタミネーションを防止
過塩素酸	シグマ・アルドリッチ	244252	代謝中にCO 2を放出 試験
ピルビン 酸	シグマ・アルドリッチ	P5280	カスタムメディアの作成に使用
シンチレーションカウンター	ベックマン・コールター	LS6500	放射能を から測定します。 濾紙
シンチレーション液	MPバイオメディカル	882453	RAMs から放出されるエネルギーを吸収します そしてそれを閃光として再放出
シンチレーションバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03-337-1	シンチレーション用反応容器 流体
炭酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761	ミディアム用バランスバッファー
水酸化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	58045	メタボイルクアッセイ中にCO2をトラップ
オレイン酸ナトリウム	サンタクルス	SC-215879	BSA共役脂肪酸 準備
真空ろ過 1000	TPPとは	99950	フィルター cMEMα

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