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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査
されています
1. 青色光照明用LEDの準備
- タブレット/電話にインストールされている関連アプリケーションを使用して、LEDパネルをオンにします。分光器のプローブを6ウェル皿の空のウェルに入れ、アプリケーションを通じてLED光を~456nmの波長ピークに調整します。光パワーメーターの光センサーを空のウェルに置き、LEDライトのパワーを調整します(~0.61 mW / cm2)。LEDライトの設定は保存でき、アプリケーションで取得できます。
- ディッシュ/LEDパネルの設定を28°Cのインキュベーターに導入し、48 hpfで魚のイメージングを開始する前に、このステップを完了します。
2. 光遺伝学的TDP-43を発現するゼブラフィッシュ仔魚のイメージング
- Plan-Neofluar 5x/0.15対物レンズを装備した落射蛍光顕微鏡を使用して、脊髄モーターカラムのRFP(opTDP-43h)またはEGFP(EGFP-TDP-43z)蛍光に基づいて、少なくとも47 hpfより前のTg[mnr2b-hs:opTDP-43h]ダブルトランスジェニック魚を選択します。
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]ダブルトランスジェニック魚をデコリオネートします。
- 250 μg/mLの3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩を含む1%低融点アガロースを42°Cで予熱します。
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] ダブルトランスジェニックフィッシュを、同濃度のトリカンを含むE3バッファーで48 hpfで簡単に麻酔します。
- 予熱した1%低融点アガロースを室温でガラスベース皿に一滴垂らします。ガラス皿の上のドーム型のアガロース滴の直径は8〜10mmです。
- パスツールピペットを使用して、麻酔をかけた魚をガラスベース皿の低融点アガロースに加え、数回ピペッティングして混合します。魚と一緒にアガロースに加えられるE3バッファーの量を最小限に抑えます。
- アガロースの固化中(通常は~1分)に注射針を使用して魚を横向きに維持し、脊髄が適切な水平位置にあることを確認します。固化後、ドーム型のアガロースマウント魚にE3バッファーを数滴垂らします。
- 開口数1.00の20倍水浸対物レンズを装備した共焦点顕微鏡でスキャンし、スキャン速度4.0μs/ピクセル(12ビット/ピクセル)、対物レンズのステップサイズ1.0μm/スライス、励起/発光波長の組み合わせを使用して、脊髄の連続共焦点z切片を取得します。 チャネル 1) EGFP の場合は 473/510 nm、チャネル 2) mRFP1.
の場合は 559/583 nm
手記： 魚の腹側にあるクロアカは、参照として関心領域(ROI)に含まれており、時間経過時の脊椎セグメント(レベル16〜17)を特定して比較するのに役立ちます。
- イメージングが完了したらすぐに、シリンジ針でアガロースを慎重に割って、魚をアガロースから取り出します。魚がアガロースに埋め込まれる時間はできるだけ短くしてください、ただし、<30分間のアガロースの埋め込みは魚の生存能力に影響を与えません。
3. 青色発光ダイオード(LED)光の野外照射によるopTDP-43h発現魚の光刺激
- 7.5 mLのE3バッファーをウェルに加え、画像化されたTg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]ダブルトランスジェニックフィッシュをウェルに入れます。スペーサーでディッシュとLEDパネルを5mm離して、6ウェルディッシュをLEDパネルに置きます(例:ample、5つのスライドグラスを積み重ねます)。
- 青色のLEDライトを点灯します。Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]ダブルトランスジェニックフィッシュの一部は、照明なしのコントロールフィッシュが必要な場合(つまり、暗い状態)にアルミホイルで覆われた別の6ウェルディッシュに保管してください。
- 照明後(例えば、図1の72 hpfで24時間)、ステップ2.3〜2.9を繰り返して、照らされた魚の脊髄を画像化します。
