タンパク質相分離アッセイ:ゼブラフィッシュ幼生の脊髄運動ニューロンにおける変異型RNA結合タンパク質相分離のための光遺伝学的手法

要約

出典:浅川氏、K.他ゼブラフィッシュ幼生の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移。J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、光感受性オリゴマー化ドメインに融合した天然変性領域を含む細胞内タンパク質を青色光曝露により誘導し、膜のない液体様凝縮物に自己会合させる相分離アッセイについて説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査

されています

1. 青色光照明用LEDの準備

1. タブレット/電話にインストールされている関連アプリケーションを使用して、LEDパネルをオンにします。分光器のプローブを6ウェル皿の空のウェルに入れ、アプリケーションを通じてLED光を~456nmの波長ピークに調整します。光パワーメーターの光センサーを空のウェルに置き、LEDライトのパワーを調整します(~0.61 mW / cm²)。LEDライトの設定は保存でき、アプリケーションで取得できます。
2. ディッシュ/LEDパネルの設定を28°Cのインキュベーターに導入し、48 hpfで魚のイメージングを開始する前に、このステップを完了します。

2. 光遺伝学的TDP-43を発現するゼブラフィッシュ仔魚のイメージング

1. Plan-Neofluar 5x/0.15対物レンズを装備した落射蛍光顕微鏡を使用して、脊髄モーターカラムのRFP(opTDP-43h)またはEGFP(EGFP-TDP-43z)蛍光に基づいて、少なくとも47 hpfより前のTg[mnr2b-hs:opTDP-43h]ダブルトランスジェニック魚を選択します。
2. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]ダブルトランスジェニック魚をデコリオネートします。
3. 250 μg/mLの3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩を含む1%低融点アガロースを42°Cで予熱します。
4. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] ダブルトランスジェニックフィッシュを、同濃度のトリカンを含むE3バッファーで48 hpfで簡単に麻酔します。
5. 予熱した1%低融点アガロースを室温でガラスベース皿に一滴垂らします。ガラス皿の上のドーム型のアガロース滴の直径は8〜10mmです。
6. パスツールピペットを使用して、麻酔をかけた魚をガラスベース皿の低融点アガロースに加え、数回ピペッティングして混合します。魚と一緒にアガロースに加えられるE3バッファーの量を最小限に抑えます。
7. アガロースの固化中(通常は~1分)に注射針を使用して魚を横向きに維持し、脊髄が適切な水平位置にあることを確認します。固化後、ドーム型のアガロースマウント魚にE3バッファーを数滴垂らします。
8. 開口数1.00の20倍水浸対物レンズを装備した共焦点顕微鏡でスキャンし、スキャン速度4.0μs/ピクセル(12ビット/ピクセル)、対物レンズのステップサイズ1.0μm/スライス、励起/発光波長の組み合わせを使用して、脊髄の連続共焦点z切片を取得します。 チャネル 1) EGFP の場合は 473/510 nm、チャネル 2) mRFP1.
   の場合は 559/583 nm 手記： 魚の腹側にあるクロアカは、参照として関心領域(ROI)に含まれており、時間経過時の脊椎セグメント(レベル16〜17)を特定して比較するのに役立ちます。
9. イメージングが完了したらすぐに、シリンジ針でアガロースを慎重に割って、魚をアガロースから取り出します。魚がアガロースに埋め込まれる時間はできるだけ短くしてください、ただし、<30分間のアガロースの埋め込みは魚の生存能力に影響を与えません。

3. 青色発光ダイオード(LED)光の野外照射によるopTDP-43h発現魚の光刺激

1. 7.5 mLのE3バッファーをウェルに加え、画像化されたTg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]ダブルトランスジェニックフィッシュをウェルに入れます。スペーサーでディッシュとLEDパネルを5mm離して、6ウェルディッシュをLEDパネルに置きます(例:ample、5つのスライドグラスを積み重ねます)。
2. 青色のLEDライトを点灯します。Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]ダブルトランスジェニックフィッシュの一部は、照明なしのコントロールフィッシュが必要な場合(つまり、暗い状態)にアルミホイルで覆われた別の6ウェルディッシュに保管してください。
3. 照明後(例えば、図1の72 hpfで24時間)、ステップ2.3〜2.9を繰り返して、照らされた魚の脊髄を画像化します。

結果

図1:光刺激前後のopTDP-43hとEGFP-TDP-43zのレシオメトリック比較。(A)48 hpf および 72 hpf の 4 つの単一 mnr2b 陽性細胞の体体をカバーする ROI は、EGFP-TDP-43z シグナルに基づいて描画され、マゼンタで示されています。長方形のROI(bg)を使用して、バックグラウンド信号(バックグラウンドROI)を減算しました。図は浅川らから引用しています。(B)opTDP-43hからEGFP-TDP-43zまでの相対強度を、RFP/GFP比として各時点の各セルについてプロットした。アスタリスクで示されているセル #1 は、EGFP-TDP-43z 信号が飽和しており、RFP/GFP 値が過大評価されていたため、レシオメトリック比較には適していませんでした。バーは10...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
共焦点顕微鏡	オリンポス	FV1200
落射蛍光顕微鏡	ツァイス	アクシオイメージャーZ1
蛍光実体顕微鏡	ライカ	MZ16FA
ガラスベースディッシュ	いわき	〒3910-035
孵卵器	ミー	CN-25Cの
LEDパネル	ナノリーフリミテッド	Nanoleaf AURORAスマートキット
対物レンズ	オリンポス	XLUMPlanFL N 20×/1.00
対物レンズ	ツァイス	プラン-ネオフルア 5x/0.15
光パワーメーター	日置	3664
光学センサー	日置	9742-10
6ウェルディッシュ	隼	353046
分光器プローブ BLUE-Wave	StellerNet株式会社	ビス-50
シリンジ針	テルモ	NN-2725R
トリケーン	シグマ・アルドリッチ	A5040 (英語)
NuSieve GTG アガロース	ロンザ	50181

の 名