低分子殺線虫剤スクリーニングアッセイ:Ditylenchus dipsaciに対する潜在的な殺線虫剤をスクリーニングするための中スループット法

Abstract

出典:Cammalleri, S. R., et al. Cultturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオでは、線虫に対する低分子殺線虫剤の有効性を特定するためのスクリーニングアッセイを実演します。殺線虫剤は、ばく露後に試料中の移動性線虫の数を減少させる場合に有効であると考えられています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査

されています

1. in vitro低分子スクリーニング

1. 以下の手順に従ってアッセイプレートを調製します。
   1. オートクレーブ処理した蒸留水を滅菌トラフに注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して、トラフから40 μLの蒸留水を平底96ウェルプレートの各ウェルに分注します。
2. ピン留めツールを準備し、薬品を追加します。
   1. 実験室のベンチのブンゼンバーナー炎の近くにピナートレイ(材料表を参照)を設置します。連続するピナートレイに以下を追加します:25 mLのピン洗浄液、35 mLの50% DMSO(水中)、45 mLの蒸留水、55 mLの70% EtOH、および65 mLの95%EtOH。.各トレイの前にあぶらとり紙を1枚置きます。
   2. ピンを洗浄液に浸し、溶液中でピンを上下に3回(3倍)動かして、ピン留めツールを清掃します。このプロトコルでは、「3x」と「10x」は、溶液内でピナーをそれぞれ3回または10回上下に動かすことと定義されています。あぶらとり紙でピンを拭き取ります。この手順をもう一度繰り返します。
      1. 次に、ピンを蒸留水で3回すすぎ、続いてピンを吸い取ります。手順をもう一度繰り返します。
      2. 最後に、ピンを95%EtOHで3回すすぎ、続いてピンを吸い取ります。もう一度繰り返します。ピナーを炎にかけ、エタノールを蒸発させます。
   3. 96ウェルケミカルストックプレートからアッセイプレートに薬品を添加するには、ケミカルプレートに3xピンを固定し、次にピンを10Xアッセイプレートに移します。洗浄液の前の紙に吸い取ります。
   4. プレート間のピン留めツールをクリーニングし、ブロッティングペーパーで撲滅します:50%DMSOで3回(1回)、蒸留水で3回(1回)、75%EtOHで3回(1回)、95%EtOHで3回(2回)。ピナーを炎にかけ、エタノールを蒸発させます。
   5. すべてのピン留めが完了したら、手順1.2.2を繰り返します.
      手記： スクリーニングは、最終濃度60μMで行いました。
3. ワームの追加
   1. まず、低保持チップを使用して5 μLをリ懸濁し、次に低保持チップを使用して観察用のスライドにピペッティングすることにより、コレクションから線虫の数をカウントします。解剖顕微鏡を使用して、5μL中の線虫の数を数えます。
      1. 滅菌蒸留水を使用して濃度を2ワーム/μLに調整します。マルチチャンネルピペットとトラフを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに10 μL(~20ウォーム)を加えます><。 手記：約 15,000 個の D. dipsaci センチュウが、記載された培養および収集方法を使用して、培養プレートごとに収集されます。井戸ごとに20個のワームが使用されるのは、数が少ないため、移動可能なものと動かないものを明確に視覚化して計算できるためです。
   2. プレートを実験室の包装フィルムで密封し、広告で包みますamp ペーパータオル。箱に入れ、200rpmにセットした20°Cの振とうインキュベーターの粘着パッドに貼り付けます。追加の広告を追加して、プレートがボックス内で安定していることを確認しますamp プレートの動きを最小限に抑えるためのペーパータオル
   。

2. データの収集と分析

1. 5日目に解剖顕微鏡でプレートを観察します。DMSO溶媒コントロールおよび薬剤処理ウェル中のD.dipsaciのモバイル数と総数をカウントします。
   1. 線虫が比較的動かない場合は、最終濃度40 mMに1 M NaOHを2 μL加えてウェルに添加し、動きを刺激します
      手記： NaOHを添加すると、線虫は瞬時に動き、5分以内に観察する必要があります。移動性ワームの数と線虫の総数は、移動性線虫の割合を計算するために使用されます。アッセイの長さは、スクリーニングの目的によって異なる場合があります。
2. 移動性ワームの割合を計算します。D. dipsaci のスクリーニングでは、0% の移動性ワームが再現性を持って生成されたウェルは、ストロングヒットに分類されます。
   手記：解剖顕微鏡のステージ上でのプレートの長時間の曝露は、光源がプレートを加熱し、バイオアッセイにさまざまな影響を誘発する可能性があるため、回避されます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50mLビーカー	パイレックス	CLS100050
96ウェルプレート	ザルシュテット	83.3924
アルミホイル	アルカンプラス
範囲を解剖する	ライカ	ライカMZ75
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	472301から500ミリリットル
スライドガラス	マグナ	60〜1200
糸くずの出ないあぶらとり紙	V&Pサイエンティフィック	VPの522-100
ローリテンションピペットチップ(200uL)	LABFORCEの	1159M44
マルチチャンネルピペット	エッペンドルフリサーチプラス	3125000036
NaOH	シグマ・アルドリッチ	S8045-500G
パラフィルム	ビーミス	PM-996
ピンクリーニングソリューション	V&Pサイエンティフィック	VP110Aの
ピナー	V&Pサイエンティフィック	VP381Nの
ピナーリンストレイ	V&Pサイエンティフィック	VPの421
マルチチャンネルピペット用の蓋付き試薬リザーバー	シグマ・アルドリッチ	BR703459
振盪インキュベーター	ニューブランズウィックサイエンティフィック	I26