In vitro石灰化アッセイ:Alizarin Red S染色および抽出による骨移植代替物上の骨芽細胞カルシウム沈着物を定量するための比色法

要約

出典:Kampleitner, C. et al. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、アニオン性色素であるAlizarin Red Sを使用して骨芽細胞から分泌されるカルシウム沈着物を検出する方法について説明します。培養した骨芽細胞を最初に染色し、次に色素を回収して、カルシウム沈着物の比色定量化または骨芽細胞の石灰化の程度を測定します。

プロトコル

1. 骨芽細胞の石灰化アッセイ

1. 直径 14 mm の β-リン酸三カルシウム(β-TCP)ディスクを 1 mL の骨増殖培地(BGM)に 1 mL の骨増殖培地(BGM)で 37 °C および 5% CO₂ で 24 時間インキュベートしてから、骨芽細胞(OB)を添加します。コントロールには標準的な組織培養プレートを使用し、生体材料サンプルには懸濁培養プレートを使用して、プラスチックへの細胞付着を防ぎます。
2. インキュベーション前培地を吸引し、BGM中にマウスの初代OBを再懸濁します。24ウェル懸濁培養プレートのインキュベート済みβ-TCPディスクに8.8 x 10⁴ OBs/cm²を添加し、対照群の場合は24ウェル組織培養プレート(1 mL/ウェル)に添加します。OBは、組織培養プレートまたは生体材料サンプルに付着します。
3. OB添加の24時間後に、BGMを含む1 mLの骨形成性石灰化培地(MM)、50 μg/mLアスコルビン酸、および5 mM β-グリセロリン酸と交換し、37°Cおよび5%CO₂で14日間インキュベートします。2〜3日ごとに、調製したばかりのMMを各ウェルに1mLずつ入れ替えます。

2. Alizarin Red S(ARS)による染色による骨芽細胞の石灰化

評価

1. MMの添加から14日後に、一次OBを含むウェルから培地を吸引し、RTで0.5mLの1x PBSで2回すすぎます。PBSを吸引し、10%緩衝ホルマリン溶液0.5mLをRTで10分間添加して細胞を固定します。
2. 10%緩衝ホルマリンをシングルユースピペットで吸引し、0.5 mLの超純水で2回洗浄します。
3. 固定したOBに、超純水に溶解した40 mM ARS染色溶液(pH 4.2)0.25 mLを加え、プレートを室温で10分間、シェーカーで100シェイク/分でインキュベー
トします。
4. シングルユースピペットで染色溶液を吸引し、1 mLの超純水ですすいでください。この手順を5〜10回繰り返して、非特異的な汚れを取り除きます
   手記： すすぎ液は色なしでする必要があります。
5. 超純水を吸引し、冷たいPBS1mLを加えます。プレートを室温で10分間、シェーカーで100シェイク/分でインキュベー
トします。
6. PBSを吸引し、染色されたβ-TCPディスクを新しいウェルに移し、フラットベッドスキャナーでプレートをスキャンして鉱化作用を記録します。
7. 0.25 mLの10%塩化セチルピリジニウム溶液を添加し、プレートを室温で15分間、シェーカーで100シェイク/分でインキュベートして、ARS色素を抽出します。
8. 上清を1.5 mLチューブに移し、17,000 x gでRTで5分間遠心分離します。
9. 10%塩化セチルピリジニウム溶液を1:10〜1:20の希釈比で抽出物に加え、サンプル(300 μL)を、10%塩化セチルピリジニウムのみを含む2つのブランクウェルを含む96ウェルプレートに加えます。
10. 40 mM の ARS 染色溶液(pH 4.2)を 10% 塩化セチルピリジニウム溶液で希釈して、4 μM から 400 μM の範囲の 7 つの ARS 標準試料を調製し、標準曲線を作製します。
11. 300 μLのリファレンススタンダードを96ウェルプレートに2回ずつ加えます。
12. サンプル、ブランク、および参照標準の520nmでの吸光度を読み取ります。
13. 参照標準とサンプルの読み取り値からブランクの読み取り値を差し引きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
β-リン酸三カルシウムディスク(β-TCP、14 mm)			ディスクを1150°Cの温度でマッフル炉で焼結し、サンプルをUV照射(片面15分)してから細胞培養に使用しました
アリザリンレッドS	シグマ・アルドリッチ	A5533の
骨成長培地(BGM)			α-MEM + 10% 熱不活化 FBS + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン
ホルマリン溶液中性緩衝液10%	シグマ・アルドリッチ	HT501128
塩化ヘキサデシルピルジニウム(セチルピリジニウム)一水和物	シグマ・アルドリッチ	C9002
L-アスコルビン酸2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物	シグマ・アルドリッチ	A8960
MEMアルファミディアム(α-MEM)	ギブコライフテクノロジーズ	11900-073
骨形成性鉱化培地(MM)			α-MEM + 10% 熱不活化 FBS + 1% ペニシリン - ストレプトマイシン + 50 μg/mL アスコルビン酸 + 5 mM β-グリセロリン酸
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P4333
リン酸緩衝生理食塩水 1x (PBS) pH 7.4	Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
β-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物	シグマ・アルドリッチ	G5422
超純水:細胞培養水 パイロジェンフリー	VWRの	L0970-500
96ウェル透明プレート	グライナーバイオワン	655001
24ウェル懸濁培養プレート	グライナーバイオワン	662102
24ウェル組織培養プレート	グライナーバイオワン	662160
遠心分離機:VWR Mega Star 600R	VWRの
CO2インキュベーター:HeraCell 240	サーモサイエンティフィック
フラットベッドスキャナー:エプソンパーフェクション1200写真	エプソン
Infinite M200 Pro マイクロプレートリーダー	テカン
微量遠心チューブ:エッペンドルフチューブセーフロック1.5mL	VWRの	21008-959
振盪インキュベーター GFL3032	GFLの	3032
シングルユースピペット:血清ピペット	グライナーバイオワン	612301