初期血管新生評価のためのビーズスプラウティングアッセイ:周皮細胞の存在下での内皮スプラウティングを研究するためのインビトロビーズベースモデル

要約

出典:Azam, S. H. et al.内皮細胞ビーズ発芽アッセイへの周皮細胞の組み込み。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、血管新生の初期段階における内皮の発芽を研究するために、周皮細胞を組み込んだ改良型マイクロキャリアビーズベースのアッセイを実演しています。このアッセイは、血管新生の分子メカニズムと抗血管新生治療薬の効果を理解するためのin vitro実験モデルを提供します。

プロトコル

1. ゲル注入用ビーズの準備

1. ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)と周皮細胞でコーティングされたマイクロキャリアビーズを含む培養物を取ります。
2. マイクロキャリアコーティングされたビーズを含むディッシュを20X対物レンズを使用して顕微鏡で観察し、すべてのビーズが内皮細胞によって十分にコーティングされていることを確認します。
3. 細胞のめっき溶液を勢いよくピペットで動かして6cmプレートから細胞を剥がし、溶液をチューブに入れます。プレートを完全なメディアでさらに2回洗浄し、チューブに移して、プレートに付着する可能性のあるすべての残留ビーズを収集します。
   1. 気泡の持ち込みを避け、p1000ピペットを使用して、内皮細胞でコーティングされたビーズへのせん断応力を最小限に抑えます。
4. 溶液中のビーズがチューブの底に沈殿するまで3分間待ちます。
5. p1000ピペットチップを使用して、ビーズペレットを乱さないように、できるだけ多くの上清を取り除きます(真空吸引器は使用しないでください)。
6. 各チューブに1 mLの完全培地を加え、ビーズを再懸濁します。
7. ビーズが底に落ち着くまで30〜60秒待ちます。次に、ビーズペレットを乱さずに、P1000ピペットを使用してできるだけ多くの上清を取り除きます。真空吸引器は、ビーズペレットを誤って取り外す可能性が非常に高まるため、使用しないでください。
8. 手順 1.6 と 1.7 をさらに 2 回繰り返します。目標は、6cmプレートから剥がれた可能性のある浮遊性HUVECをできるだけ多く除去することですが、HUVECコーティングされたビーズは、丸底の蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブに自由浮遊細胞よりも早く沈殿するはずです。
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9. mLの完全培地をビーズに加えます。

2. コーティングされたビーズをフィブリンゲルに埋め込む

1. P1000ピペットを使用して、各FACSチューブ内のビーズペレットを乱さないように、できるだけ多くの媒体を取り除きます。
2. ビーズを2.5 mLのフィブリノーゲン溶液に再懸濁します。
3. 13 μLのトロンビン溶液を24ウェルガラス底プレートの各所望のウェルにピペットで移します。ガラス底のプレートへのめっきは、芽の最適なイメージングを可能にするために不可欠です.
   注:次のステップの前に、トロンビンをウェルに5〜10分以上放置しないでください。
4. 各ウェルに0.5 mLのビーズ/フィブリノーゲン溶液を添加します。
   1. 毎回、溶液をピペッティングする前に、ビーズ溶液を十分に再懸濁してください。
   2. ウェルにすでに存在するトロンビンに直接慎重にピペットで移すように注意してください。ゆっくりと2〜3回ピペットで上下させて溶液を完全に混合し、気泡が入らないように注意します。
   3. ピペットチップは必ずウェル間で交換してください。
   4. 最初のフィブリン凝固中は、動きがゲル形成を乱す可能性があるため、プレートを動かしたり邪魔したりしないように注意してください。.
5. プレートをフードに常温で30分間置いておきます。
6. プレートを37°Cのインキュベーターに慎重に移し、さらに1.5〜2時間かけてゲルが完全に固化
します

3. フィブリンゲルの上に線維芽細胞をめっき

する

1. ゲルが固化してから最後の30分間で、次のように正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)を剥離します。
   1. T175フラスコで細胞を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、5 mLの細胞剥離溶液を加えて37°Cで10分間インキュベートします。
   2. NHLFを20,000細胞/mLの濃度で完全培地に再懸濁します.
      注:NHLF細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養できます。
2. NHLF細胞懸濁液1 mLを各ウェルのゲルにプレートし、インキュベーターに戻します。
3. アッセイ期間中、一日おきに完全な培地を交換してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌ピペットチップ	VWRの
ピペッター	エッペンドルフ
EGM2メディアブレットキット一式	ロンザ	CC-3162	HUVEC のメディア
MEM	ギブコ	11095114	10T1/2 のメディア
DMEM	ギブコ	11965118	NHLFのメディア
組織培養グレードのPBS	ギブコ	14190-144	マグネシウム、カルシウムフリー
アキュターゼ	ライフテクノロジー	A1110501	HUVECの吊り上げ用
トリプシン	ライフテクノロジー	15050065	10T 1/2およびNHLFの吊り上げ用
ヒューベック	ロンザ	C2517Aシリーズ
10T 1/2	ATCCの
NHLF	ATCCの
Cytodex 3マイクロキャリアビーズ	シグマ	C3275
組織培養コーティングされた6cmおよび10cmプレート	コーニング
ウシ血漿由来のフィブリノーゲン	シグマ	F8630
トロンビン	シグマ	T9549
アプロチニン	シグマ	A3428の
ファルコンラウンドボトムチューブ	コーニング
組織培養用インキュベーターとフード
24ウェルガラス底板	マテック	P24G1.513Fの	ガラス底板は、芽を画像化する場合にのみ必要です。そうでない場合は、組織培養プラスチックも許容されます。

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