幼虫接触アッセイ:試験幼虫殺虫化合物との直接接触後の蚊の幼虫死亡率を評価する手順

要約

出典:Brito-Sierra, C. A., et al.Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes, J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、いくつかのヒト感染症の既知の媒介者である蚊の第3幼虫に対するドーパミン受容体拮抗薬アミトリプチリンの毒性を評価するための幼虫接触アッセイについて説明します。異なる時間間隔で異なるアミトリプチリン濃度とインキュベーションした場合の幼虫の死亡率を評価することは、その致死濃度を決定するのに役立ちます50。

プロトコル

1. Larval Contact Assay (Single Point Dose or Dose Response Assay)

>注:このアッセイは、試験井戸内のDMSOの最終濃度が1%を超えない限り、水またはジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶な化学物質で実施できます。代替溶媒も選択肢の一つかもしれませんが、まず、曝露後72時間で最終濃度が10%を超える死亡率を引き起こさないことを確認することが不可欠です。アッセイは、シングルポイント用量アッセイまたは用量反応アッセイとして実施されてもよい。後者を実行する場合は、予想されるLC₅₀にまたがる濃度の範囲(最低5つ)をテストすることをお勧めします。

1. 透明な24ウェル組織プレートのウェルにラベルを付けます。
2. 試験化学のストック溶液を1.5mLチューブに調製します。
   1. 分析天びんを使用して各ケミストリーを秤量し、溶解性特性に応じて、滅菌済みのddH₂O、DMSO、または選択した別の適切な有機溶媒に再懸濁します。
      手記：計算では、化学物質の純度を考慮に入れる必要があります。たとえば、純度が99%のケミストリーの場合、10.1 mgを1,000 μLのアセトンに溶解して1%の溶液を得ます。パラフィンフィルムで密封し、-20°Cで保存します。
3. 評価する試験化学の最終濃度を決定し、適切な溶媒を使用して、それに応じてストック溶液から段階希釈液を調製します.
   手記：化学と溶媒の濃度と体積は、C1 * V1 = C2 * V2の式を使用して計算できます(C1 =サンプル1の濃度、C2 =サンプル2の濃度、V1 =サンプル1の体積、V2 =サンプル2の体積)。
   1. 10 mMのストック溶液を調製し、必要に応じて段階希釈して、目的の試験濃度を得ます(表1B)。
4. 幅広のプラスチック製トランスファーピペットを使用して、5匹のL3幼虫を組織培養試験プレートのウェルに移します。L3幼虫は、長さ(~2.5-3.5 mm)と頭嚢の幅~0.025 mmで認識できます。1mLピペットで水を静かに取り出し、それを所望の量のddH₂Oと交換します。
5. 24ウェルテストプレートの4つのレプリケートウェルのそれぞれに適切な量のテストケミストリーを追加し、プレートを静かに渦巻かせてケミストリーが均一に混合されるようにします。プレートを一定の条件下でテストチャンバーまたは成長チャンバーに置きます(たとえば、25°Cおよび~75-85%RHを推奨し、可能であれば12時間のライト/12時間のダークサイクル).
   手記：実験間の再現性を確保するため、その後のアッセイは同じ環境条件下で実施してください。
6. 曝露後30分、1時間、1.5時間、2時間、3時間、24時間、48時間、および72時間後(または別の時点)に、各ウェル内の死んだ/反応しない幼虫の数をスコアシートに記録します(表2)。プレートの側面を軽くたたきます。動きが観察されない場合は、滅菌したつまようじで幼虫にそっと触れてください。タップ/タッチに反応しない幼虫を「死んだ」と評価します.
   手記：他の形態学的および行動的な表現型が観察され、記録され得る。
7. 必要に応じて、次のように修正されたアボットの式を使用して制御死亡率を修正します:
   死亡率 (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
   ここで、X = 処理されたサンプルの死亡率、Y = コントロールの死亡率です。
8. グラフは、Graph-pad Prism 6などの選択したソフトウェアを使用してヒストグラムまたは対数曲線としてグラフ化し、コントロールに対する致死濃度(LC)値を計算します。
9. 蚊の別のバッチを使用してアッセイを繰り返し、n = 3以上の生物学的複製を取得します。

>表 1.ネッタイシマカL3幼虫の(A)シングルポイント用量アッセイおよび(B)用量反応アッセイの計算例。

A. 3つのケミストリーによるシングルポイントドーズアッセイ
化学	濃度 (400 uM)
アミトリプチリン	80 mM ストック: 2 mg のアミトリプチリン X 98% (粉末の純度) X 0.001 g/1 mg X 1 mol /313.86 g X 1 L/0.08 mol X 106 μL/L = 78.06 μL の水。
	段階希釈:ストックをddH2Oで1:2に希釈し、次に1:4で希釈して10 mMを達成します。960 μL の ddH20 を含むウェルに 40 μL の 10 mM ストックを添加し、最終濃度 400 μM/ウェルを達成します。10 mMストックを1:2で段階希釈して、5 mM、2.5 mM、1.25 mM、および0.625 mMストックを達成します。
Cis-(z)-flupenthixol	80 mM ストック: 2 mg の cis(z)flupenthixol X 98% (粉末の純度) X 0.001 g/1 mg X 1 mol/507.44 g cis(z)flupenthixol X 1L/0.08 mol X 106 μL/L = 48.28 μL の水。
	段階希釈:上記と同様。
アミトラズ	>80 mM ストック: 2 mg の Amitraz X 0.001 g/1 mg X 1 mol/293.4 g の amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 μL/1 L = 85.21 μL の DMSO (注: Amitraz は DMSO にのみ可溶です)。
	段階希釈:上記と同様。
>B. 用量反応アッセイ
化学	用量1	用量2	ドーズ3	用量4	用量5
	400 μM	200 μM	100 μM	50 μM	25 μM
例:アミトリプチリン、cis-(Z)-フルペンチクソールオラミトラズ	40 μL	40 μL	40 μL	40 μL	40 μL
	10 mMストック	5 mMストック	2.5 mMストック	1.25 mMストック	0.625 mMストック

>表 2.蚊の幼虫の用量反応アッセイからのデータを記録するために使用されるスコアシートの例。コントロール、水のみ、または1%DMSOまたは他の溶媒のみを含む水。アミトリプチリンなどの低分子アンタゴニストケミストリーの試験に使用される一般的な用量は、25 μM、50 μM、100 μM、200 μM、および400 μMです。

名 名 名 名 名 名 名 名

蚊のL3幼虫アッセイ
開始日:
調査員:
種/株:
>アッセイタイプ:シングルポイント用量/用量反応
死亡率(死んだ蚊の数)
時間 (時間)	用量1	用量2	ドーズ3	用量4	用量5	コントロール
0.5
1
1.5
2
2.5
3
12
24
48
72
死亡率
時間 (時間)	用量1	用量2	ドーズ3	用量4	用量5	コントロール
0.5
1
1.5
2
2.5
3
12
24
48
72

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
殺虫剤感受性蚊株	Malaria Research and Reagent Reference Repository(マラリア研究および試薬参照リポジトリ)		https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx;推奨 株:ネッタイシマカ(LVP)株、ハマダラカ Kisumu(KISUMU1)株とCulex quinquefasciatus Johannesburg(JHB)株
アセトン	マリンクロット・ケミカル	CASの67-64-1	希釈および制御のための使用
アミトラズ	シグマ・アルドリッチ	CASの33089-61-1	DMSOでの希釈が必要
アミトリプチリン	シグマ・アルドリッチ	CASの:549-18-8	アセトンで希釈できます
シス-(Z)-フルペンチキソール	シグマ・アルドリッチ	CASの番号:51529-01-2	DOP様受容体の破壊因子として薬理学的に試験済み
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	MKBF2985	amitrazを溶解するために使用される有機溶剤
蓋付き24ウェル細胞培養プレート	コーニングインコーポレイティッド	3526
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-711-7M	幼虫の選別に使用
実体顕微鏡	オリンポス	SZ6045	幼虫アッセイのスコアリングとマイクロアプリケーションの実行に使用

名