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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査
されています
1. 蚊の成虫の文化
>注:殺虫剤に弱い蚊の株は、Malaria Research and Reagent Reference Repositoryから入手できます。推奨される株は、ネッタイシマカ(LVP)株、ハマダラカガンビアエキスム(KISUMU1)株、およびCulex quinquefasciatusヨハネスブルグ(JHB)株です。
- Nussが説明したように、28°C、相対湿度(RH)75-85%の28°Cで12時間の昼/12時間の夜間サイクルで卵から蚊の幼虫を培養します(トレイあたり~400匹の幼虫)。幼虫のスナネズミ(A.aegyptiおよびAn.gambiae)またはフレーク状の魚の餌(C.quinquefasciatus)を与えます。幼虫アッセイでは、3番目の幼虫(L3)インスターステージで幼虫を収集します。
- プラスチックカップに移された蛹からの成虫の蚊を後部に戻し、上記の条件下で昆虫の20Lプラスチックケージ内に置きます。他の場所で説明されているように、蚊を20%砂糖溶液に維持します。発芽後3〜5日で成虫を採集します。
2. Adult Topical Assay (Single Point Dose or Dose Response Assay)
>注:成人局所アッセイは、アセトンを溶媒として使用して実施されます。代替溶媒も選択肢の一つかもしれませんが、まず、曝露後48時間で最終濃度が10%を超える死亡率を引き起こさないことを確認することが不可欠です。このアッセイは、シングルポイント用量または用量反応アッセイとして実施することができ、致死量(LD)を決定するために使用されます。後者を実行する場合は、予想されるLD50にまたがる濃度の範囲(最低5つ)をテストすることをお勧めします。
- アッセイを完了するために必要な成虫の雌の蚊の数を決定します.
手記：単一のケミストリーによるポイントドーズアッセイには、最低90匹の蚊が必要です(ポジティブコントロールに30匹、アセトンのみのネガティブコントロールに30匹、テストケミストリーに30 匹)。
- 生後3〜5日の成虫の雌の蚊を培養し、吸引器を使用して別の20 mLプラスチックバケツに移します(図1)。
- 9オンスの紙コップに、試験化学の名前と濃度をラベル付けします。カップごとに10 cm x 10 cmのメッシュの正方形と輪ゴムを取っておきます(図2を参照)。
- ポジティブコントロールとして既存の殺虫剤(合成ピレスロイド、ビフェントリンなど)を選択し、アセトン中の1%ストック溶液(10 μg/μL)を調製します
注:計算では、化学的性質の純度を考慮に入れる必要があります。たとえば、純度が99%のケミストリーの場合、10.1 mgを1,000 μLのアセトンに溶解して1%の溶液を得ます。パラフィンフィルムで密封し、-20°Cで保存します。
- 上記と同じ手順で、試験化学の原液を調製します.
手記：多くの試験化学は非常に不安定であるため、バイオアッセイを実施するたびに溶液を新鮮にすることが望ましいです。
- 図3に示すように、ストック溶液からポジティブコントロールケミストリーとテストケミストリーの連続希釈液を調製します。これは、事前にアセトンですすいだ20 mLガラスバイアルを使用して行います。
- 1 mLガラスシリンジをアセトンでパージし、アセトンを充填し、0.25 μLの容量が得られるように調整されたマイクロアプリケーターで固定します。
- 10匹ずつのバッチで作業し、吸引器を使用して生後3〜5日の成虫の雌の蚊をケージから取り除き、冷蔵庫または氷の上で4°Cで最大5分間麻酔をかけます。次に、蚊をペトリ皿に移し、氷の上に最大10分間置きます。
- 素早く作業を進め、細いピンセットで1人の女性を取り出し、シリンジマイクロアプリケーターを使用して0.25μLの試験液を背側胸部に塗布します。解剖顕微鏡を使用した観察により化学物質の送達を確認し、各蚊が適切な量の試験化学物質を受け取っていることを確認します。
- 蚊を氷の上に置いたラベル付きの紙コップに移し、9回繰り返してn = 10匹の処理された蚊を取得します。輪ゴムで固定されたメッシュスクエアでカップ内の蚊を密封し、28°Cおよび75〜85%RHの一定の条件下でプラスチック製の浴槽または成長チャンバーに移します(12時間の昼/ 12時間の夜間サイクルが望ましい)。
- 上記の実験を2回繰り返して、処理群または対照群ごとにn = 3回の技術的反復(つまり、合計30匹の蚊)を取得します。
- 手順2.7〜2.10を最初にテストケミストリーで繰り返し、次にポジティブコントロールを繰り返します.
手記：十分な蚊が利用可能な場合に含めるべき別の有用な制御は、試験化学または溶媒のいずれも受け取らない30匹の麻酔蚊の「ブランク」である。
- スコアシートを使用して、曝露後30分、60分、2時間、24時間、および48時間後(または別の時点)に「死んだ/反応しない」蚊の数を記録します(表1)。蚊が動きの欠如を示している場合、蚊は「死んでいる/反応しない」と評価します。これは、片側または背中に横たわっていて、飛べないと定義されます。
- 必要に応じて、次のように修正されたアボットの式を使用して制御死亡率を修正します:
死亡率 (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
ここで、X = 処理されたサンプルの死亡率、Y = コントロールの死亡率です。
- 結果をヒストグラムまたは指数曲線として表示します。用量反応アッセイでは、コントロールに対する試験化学のLD50、LD75、またはLD90の値を計算します。
- 蚊の別々のバッチを使用してアッセイを少なくとも2回繰り返し、n = 3以上の生物学的複製を取得します。
