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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 成人の血液供給アッセイ(Single Point Dose or Dose-Response Assay)
- 生後4〜5日の成虫の雌の蚊約150匹を集め、別のケージに移します。用量反応アッセイを実施する場合、6つのケージを得るために繰り返します。給餌アッセイの1〜24時間前に砂糖の供給源を取り除きます。
- 上記のように、化学の純度を考慮して化学のストック溶液を調製し(一般的なストック溶液は水または塩バッファーで80 mMです)、その後、必要に応じて水/バッファーで段階希釈液を調製します。
- 各希釈液40μLを除細動ウサギ血液960μLに加え、所望の試験濃度を得るためのものです。供給ユニットにメンブレンフィルムを貼り、ゴムリングでシールします。ピペットで1mLの血液を移し、フィーディングユニットを加熱ユニットに取り付けます。
- 作りたての10%乳酸溶液で膜表面をそっと綿棒で拭き、成虫の蚊のケージに給餌ユニットを置きます。ケージを暗い布または黒いゴミ袋で覆い、蚊が1時間餌をやるのを待ちます。
- 残りの試験溶液と陰性(血液のみ)コントロールについて、手順1.2〜1.4を繰り返します。
- 給餌が完了したら、バケツを4°Cの冷蔵庫に5分間入れて、蚊に麻酔をかけます。オスの蚊と餌を与えていないメスの蚊を取り除き、腹部の検査により、餌と部分的に餌を与えられた蚊の総数を数えて記録します。
- 部分的および完全に栄養を与えた雌の蚊を保持し、投与ごとに最低50匹の血液を与えられた蚊を目指します。
- バケツを28°Cおよび75〜85%RHの一定の条件下でプラスチック浴槽または成長チャンバーに移します(12時間の昼間/ 12時間の夜間サイクルが望ましい)。
- スコアシート(表1)を使用して、0.5、1、1.5、2、2、24、48、および72時間(または必要に応じて別の時点)で死んだ/反応しない蚊の総数を記録します。
- 授血後3日目に、ケージに卵カップを導入し、72時間かけて卵を採取します。解剖顕微鏡での治療ごとに生成される卵子の総数を数えます。
- 死亡率と繁殖力の割合を、各治療群と対照群の餌を与えられた蚊の総数の関数として計算します。必要に応じて、修正されたアボットの式を使用して制御死亡率を修正します。
- 毒性と繁殖力のデータを、選択したソフトウェアを使用してヒストグラムプロットまたは指数曲線(用量反応アッセイを実行する場合)として表示します。用量反応アッセイを実施する場合は、コントロールに対する試験化学のLD50、LD75、またはLD90の値を計算します。
- 蚊の別々のバッチを使用してアッセイを少なくとも2回繰り返し、n = 3以上の生物学的複製を取得します。
>表 1.成人の血液供給アッセイからのデータを記録するために使用されるスコアシートの例。アミトリプチリンなどの低分子拮抗薬の化学的性質の試験に使用される一般的な用量は、50 μM、100 μM、200 μM、および400 μMです。
| 蚊の成虫(3-5日齢)局所アッセイ |
| 開始日: |
| 調査員: |
| 種/株: |
| >Assay Type: シングルポイント用量/用量反応 |
| A. 死亡率 (死んだ蚊の数) |
| 時間 (時間) | 用量1 | 用量2 | ドーズ3 | 用量4 | 用量5 | コントロール |
| 0.5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| B. 死亡率 |
| 時間 (時間) | 用量1 | 用量2 | ドーズ3 | 用量4 | 用量5 | コントロール |
| 0.5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |