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1. レンチウイルスの生産
>注:レンチウイルスベクターの製造と操作は、組換えDNAを含む研究のための国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って行われました。野生型およびA4V変異体SOD1をコードするプラスミドに、強化されたYFP(SOD1WT-YFPおよびSOD1A4V-YFP)が用いられます。両方の遺伝子融合産物をPCRプライマーペア5'-ATCGTCTAGACACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGTGC-3'および5'-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'を使用して増幅し、XhoIおよびBsrGI制限部位を使用してpTRIP-delta U3 CMVプラスミドに挿入しました。20回以上の継代を避け、細胞の密度を60%未満に維持することで、良好なトランスフェクション効率を確保することができます。
- 1日目に、HEK-293T細胞を直径10cmの組織培養プレート(3 x 10⁶細胞/皿)で30〜40%のコンフルエンスで分割し、10 mLの細胞培養培地(10%FBSおよび4 mM L-グルタミンを含む高グルコースDMEM)でウイルス産生を行います。
- 直径10 cmの組織培養プレートをCO₂インキュベーター(37 °C、5% CO₂)に一晩保管します。
- 2日目に、10 μgのレンチウイルスベクター(pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFPまたは-SOD1A4V-YFP)とレンチウイルスパッケージングプラスミド(5 μgのpVSVg、10 μgのpCMV-dR8.71)を含むDNAトランスフェクション溶液を調製します(図1A)。1 M CaCl₂ 125 μL を加え、蒸留水を使用して容量を 500 μL に調整します。500 μLの0.05 M HEPESを混合物に穏やかに加え、室温で10分間インキュベー
トします。
- HEK-293T細胞培地を、抗生物質を含まない10 mLの温めた新鮮培地と1 mLのDNAトランスフェクション溶液と交換し、37°C、5%CO₂で一晩インキュベートします。
- 3日目に、細胞上清を新鮮な培地と交換します。
- 4日目に、15mLのチューブで上清を採取し、500 x gで5分間遠心分離して、死んだ細胞と破片を取り除きます。さらに、60mLの大型シリンジを用いて0.45μmのフィルターに上清を通し、上清を精製します。すぐにシングルユースアリコート(300μL)に分注し、-80°Cで保存します。製品の活動を最大限に維持するには、凍結融解サイクルを避けてください。
2. レンチウイルス形質導入
- 10% FBSを添加した2 mLのDMEM培地に溶解した6ウェル組織培養プレートで、60%コンフルエンス(HEK-293細胞とSH-SY5Y、ウェルあたり5 x 10⁵細胞およびU2OS、1ウェルあたり1 x 10⁵細胞)で感染する細胞株を分割します。
- 6ウェル組織培養プレートを5% CO₂の37°Cインキュベーターに一晩保管します。
- 凍結したレンチウイルスを-80°Cの冷凍庫から取り出し、使用前に氷の上でアリコートを解凍してください。再冷凍しないでください。
- ウイルスが解凍されている間に、目的の細胞株に適合する血清を含む細胞培養培地を温めます。ウイルスが完全に解凍されたら、DMEMでさまざまな希釈液(1:3、1:10、1:30、1:100)を新鮮な1.5 mLのマイクロチューブで調製します。
- チューブ内の容量を1 mLに上げ、血清培地を減らします。.
- 2 μLのポリブレン(4 μg/μLのストック)を1 mLのウイルス/培地に加えます。ピペッティングでよく混合し、1 mLの混合物を細胞に加えます。細胞をウイルスと24時間インキュベー
トします。
- ウイルス培地を取り出し、10% FBS を添加した通常の DMEM 培地と交換します。セルを37°C、5%CO₂に維持します。
- 細胞の増殖をモニターし、2日ごとに培地を交換します。合流点で、6ウェルディッシュを直径10 cmの組織培養プレートに広げます。
- 細胞が十分に増殖したら、384ウェルアッセイプレート上のDMEM培地50μLにウェルあたり1.5 x 10⁴の細胞を播種し、顕微鏡でYFPタグ付きタンパク質の発現レベルを確認します。YFPタグ付きタンパク質細胞発現がS/N比≥3を示している場合は、対応する細胞株の細胞ストックを調製します。
3. プロテアソーム阻害剤のタンパク質凝集に対する時間依存的な影響
>注:自動顕微鏡を使用して画像取得を実行します(「材料」を参照)。
- 100% DMSO(ALLN、2 mM)に溶解した0.25 μLのDMSOまたはプロテアソーム阻害剤を384ウェル平底プレートに分注します。
- ウェルあたり1.5 x 104個の細胞を、同じアッセイプレート上の50 μLのDMEM培地に手動で播種します。プロテアソーム阻害剤(ALLN)の最終濃度は10 μMである必要があります。
- 顕微鏡システムの環境制御ユニットを37°C、CO₂5%に設定します。実験セットアップのスクリーンショットを図2に示します。
- LWD 20X対物レンズ、非共焦点モード、4フィールド/ウェル、キャプチャインターバル1時間で、ソフトウェアを使用して、広視野蛍光モードで顕微鏡を操作します。各実行の終了時に、キャプチャされた画像は自動的にサーバーにアップロードされます。
4. 生細胞におけるYFP発現のタイムラプスイメージングと画像解析(シングルチャネル)
>注:次の手順では、ソフトウェア(Columbusなど)のアプリケーションについて説明します。
- 適切なアルゴリズムを選択して、主要なオブジェクト(サイトゾルと凝集体)をセグメント化します。必要に応じて、背景のしきい値とコントラストのパラメータを調整します(図3)。
- 「find cells」を使用して、YFP強度チャネルの個々のしきい値を0.1にして細胞をカウントします。相対的な YFP スポット強度 >0.2 と分割係数 1.0 の "スポット検索" アルゴリズムを使用して集計を決定します。
5. プロテアソーム阻害剤の核染色生細胞におけるタンパク質凝集に対する用量応答効果 (2チャンネル)
>注:自動顕微鏡を使用して画像取得を実行します。プロテアソーム阻害剤(ALLN、エポキソミシン、MG132)の濃度範囲を予想されるIC50値に基づいて決定し、最適なカーブフィットを確保します。
- 384ウェル保存ポリプロピレンプレート上で、標準的な1:3希釈シリーズで化合物の段階希釈液を調製します。化合物の濃度が正確であることを確認するために、化合物の希釈液をよく混合してください。
- 0.25 μL のプロテアソーム阻害剤を、空の平底黒色の 384 ウェルアッセイプレートに分注します。384キャピラリーヘッドを搭載したリキッドハンドラーを使用しており、ボリュームを移送することができます。
- 1ウェルあたり1.5 x 1010⁴の細胞を、アッセイプレート上の50 μLのDMEM培地に播種します。アッセイプレートを37°Cおよび5%CO₂で24時間インキュベー
トします。
- 10 μLのDMEM培地(37°Cで予温)を染色溶液(Hoechst 33342、ストック10 mg/mL)とともに加え、室温で10分間インキュベートします。
- 顕微鏡操作ソフトウェアを起動します。実験セットアップのスクリーンショットを図4に示します。「Configuration」タブを選択し、20X対物レンズと正しいプレートタイプを選択します。対物レンズの「カラー」が正しい値に設定されていることを確認し、さまざまなプレートタイプで適切な焦点を合わせることができます。
- 「顕微鏡」タブを選択し、露光1をYFP(488レーザー)、露光2をHoechst(405レーザー)として定義します。両方の露出でフィルターをアクティブにし、露出 1 をカメラ 1 に、露出 2 をカメラ 2 に割り当てます。露出時間を露出 1 では ~800 ミリ秒、露出 2 では ~40 ミリ秒に設定します。
- 露出1を選択します。ピント高さを0μmに設定し、「ピント」を選択します。ピントを合わせたら、カメラ1を露出します。フォーカスの高さを調整して露出面を最適化し、「高さを取る」をクリックします。露光時間とレーザー出力を変更して、最大ピクセル強度を~3,000にします。露出パラメータを保存します。露出2についても繰り返します。
- 「Experiment Definition」タブを選択し、レイアウトとサブレイアウトを作成します。関連するレイアウト、露出、参照画像、スキュークロップファイル、およびサブレイアウトをドラッグアンドドロップします。実験を保存します。
- 「Automatic Experiment」タブを選択し、画像を取得します。各実行の終了時に、キャプチャされた画像は自動的にサーバーにアップロードされます。
6. 2チャネル画像の画像解析
- 主要なオブジェクト(核、細胞質、および凝集体)をセグメント化するためのソフトウェアアルゴリズムを選択します(図5)。
- 分節化された物体を目視検査することで、原子核を正確に分節化する方法を選択します。チャネル 1 (Ch1) の Hoechst 染色されたオブジェクトを使用して、細胞の数を決定します。チャネル 2 (Ch2) の変異型 SOD1-A4V からの YFP 染色を使用して、凝集体の量を決定します。
- 「find nuclei」アルゴリズムを使用して、分割係数7.0、個別閾値0.40、コントラスト>0.10のHoechst染色領域>20μm²)として細胞をカウントします。
- データテーブルを作成し、グラフ作成ソフトウェアの「非線形回帰」式を使用して、各化合物のEC50を決定します。
