エンドトキシン活性アッセイ:血液サンプル中のエンドトキシン活性を調査するための化学発光ベースのバイオアッセイ

要約

出典:Pinciroli, R. et al.重篤な患者における全血エンドトキシン血症の検出のためのエンドトキシン活性アッセイ。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、化学発光ベースの方法により全血サンプル中のエンドトキシン活性を調査するための迅速なバイオアッセイを示しています。このアッセイは、エンドトキシン媒介性敗血症の早期診断のための迅速で高感度なバイオマーカー検査です。

プロトコル

人間の参加者が関与するすべての手続きは、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. エンドトキシン活性アッセイ (EAA)

1. EDTA抗凝固剤を含む滅菌チューブで患者の血液サンプルを採取します。血液サンプルを室温で保存する
2. 検査する必要のある患者の血液サンプルごとにEA試験管を準備します。チューブをチューブラックに入れます。次に、キャップを取り外します。
3. 各 EA テストは 5 種類のチューブから構成されており、それぞれをテストの異なる部分に使用します (次のステップを参照)。
   1. チューブ#1(「コントロール」チューブ)を使用して、特定の抗体がない場合の患者の好中球の非特異的酸化バーストの基礎活性を測定します。
   2. チューブ#2(「サンプル」チューブ)を使用して、リポ多糖(LPS)-抗体複合体に応答した酸化バーストを測定します。
   3. チューブ#3(「最大」チューブ)を使用して、過剰なエンドトキシンに反応した患者の好中球の最大酸化バーストを測定します。
   4. チューブ#4(「LPS」チューブ)を外因性エンドトキシンの供給源として使用します。
   5. 血液の保存にはチューブ#5(「アリコート」チューブ)を使用してください.
      注:チューブ#1、#2、および#3の複製が提供され、テストされる各血液サンプルに合計8本のチューブが使用されます(EA試薬ボトルと品質管理テストは、ポーチに含まれるすべてのテストに使用できます)。
4. コンビピペットを使用して、ボトルから1 mLのEA試薬を#1(コントロールチューブ)、#2(サンプルチューブ)、#3(最大チューブ)のチューブにピペットで入れます。それぞれを重複して
   注意: 溶液が跳ね返らないように、チューブの側面にピペットで下
ろします。
5. 採血管を20回静かに反転させて、患者の血液サンプルを混合します。次に、0.5 mLの患者血液をチューブ#4(LPS最大チューブ)とチューブ#5(アリコートチューブ)にピペットで入れます。ボルテックスチューブ#4を10秒間。
6. すべてのEA試験管が入ったチューブラックをインキュベーターシェーカーに入れます。蓋を閉め、37°Cの温度で10分間インキュベー
トします。
7. 蓋を開けて、インキュベーターシェーカーからチューブラックを取り外します。ボルテックスチューブ#5(アリコートチューブ)。滅菌チップを使用して、40 μLの血液をチューブ#1と#2に2回分ずつピペットで入れます。
8. ボルテックスチューブ#4(LPSチューブ)。同じピペットチップを使用して、チューブ#4からチューブ#3(最大チューブ)に40μLの血液を二重にピペットで移します。
9. 6つの最終試験管(#1、#2、#3、およびそれぞれの複製)をボルテックスし、ラックに戻します。
   注意: すべてのチューブが同じ時間ボルテックスされていることを確認してください。
10. チューブラックをインキュベーションシェーカーに戻し、蓋を閉めます。インキュベーションシェーカーを100rpmに設定し、14分間動作を開始します。
11. EAラベルの付いたチップカードをケミルミノメーターに挿入し、スタートを押します。14分間のインキュベーション後、ケミルミノメーターに表示される指示に従って、EAチューブを正しい順序で読み取ります。
12. 各チューブを10秒間静かにボルテックスしてから、化学発光計のサンプルホルダーに置きます。サンプル引き出しを開き、チューブ#1をサンプルホルダーに入れます。次に、サンプルドロワーを閉じ、相対光ユニット(RLU)の読み取りを待ちます。
13. チューブ 2 とチューブ 3 について、手順 1.12 を繰り返します。
14. 重複するチューブ1、2、および3.
    に対して手順1.12を繰り返します 手記： ステップ1.12〜1.14で、すべてのチューブを同じ時間ボルテックスしてみてください。
15. すべてのチューブが処理された後、EAの結果が自動的に計算され、印刷されることに注意してください。水準はEA単位として表され、同じサンプルからの重複測定の平均を表します。
16. 検査が必要な血液サンプルごとに、手順1.4から1.15を繰り返します。
17. アッセイが完了したら、残りの試験管とEA試薬を2〜8°Cで最大30日間保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
EAAキット	スペクトラルメディカル株式会社	EAAST-20	20テスト+1品質管理のパッケージ
スマートラインTL	ベルトルト	EAASLの	ルミノメーター
インキュベーターシェーカー	叶える	ES-20	ミニインキュベーターシェーカー
ボルテクサー	VWRの	〒444-2790	ボルテックス機器

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