比濁Limulusアメーバサイトライセートアッセイ:ナノ製剤中のエンドトキシン汚染を検出および定量化する技術

要約

出典: Neun, B. W. et al., Detection of Endotoxin Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、PEG化リポソームドキソルビシンナノ製剤におけるエンドトキシン汚染を推定するためのLimulusアメーバサイト溶解物(LAL)アッセイの比濁法形式について説明しています。エンドトキシンとLAL試薬との反応後の溶液の濁度は、サンプル中のエンドトキシンを推定するのに役立ちます。

プロトコル

1. ナノ粒子試料の調製

1. LALグレードの水で研究サンプルを調製します。
2. サンプルのpHが6〜8の範囲外の場合は、パイロジェンフリーの水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用してpHを調整します。
3. LALグレードの水を使用して、研究サンプルのいくつかの希釈液を調製します。最高希釈が最大有効希釈(MVD)を超えないようにしてください。

2. LALフォーマット間で共通の試薬の調製

1. パイロジェンフリーのLAL試薬水を使用して濃水酸化ナトリウムストックを希釈し、0.1 Nの濃度で作業溶液を調製します。
2. パイロジェンフリーのLAL試薬水を使用して濃塩酸ストックを希釈し、最終濃度0.1 Nの作業溶液を調製します。
3. コントロールスタンダードエンドトキシン(CSE)の調製
   1. メーカーから提供された分析証明書に従ってCSEを再構成します。
      手記：カタログ番号と、さまざまなLAL形式での特定のCSE製剤の適用に関する詳細については、材料表を参照してください。
4. LAL試薬の調製
   1. LAL試薬は、メーカーから提供された分析証明書に従って再構成します。
      手記：カタログ番号と、異なるLALフォーマットの特定のLAL試薬製剤の適用に関する詳細については、材料表を参照してください。

3. 濁度LALアッセイ

1. 校正標準液の準備
   1. 900 μL の LAL グレードの水と 100 μL の CSE を使用して、0.001 から 1 EU/mL の濃度範囲のキャリブレーションスタンダードを調製できるように、必要な数の中間希釈液を調製します。
   2. まず、チューブにラベルを貼り、各チューブに900μLのLALグレードの水を加えます。次に、10 μL の 10 EU/mL 溶液を添加して、濃度 1 EU/mL のキャリブレーションスタンダードを調製します。
   3. 上記のように10倍段階希釈を繰り返して、3つの低濃度キャリブレーション標準試料を調製します。0.001 から 1 EU/mL までの 4 つのキャリブレーション標準試料が調製されていることを確認します。
2. 品質管理の準備
   1. 50 μL の 1 EU/mL CSE 溶液と 950 μL の LAL グレードの水を組み合わせて、0.05 EU/mL の品質管理を準備します。
3. 抑制/増強(IEC)制御の準備
   1. 25 μL の 1 EU/mL CSE 溶液と 475 μL の試験用ナノマテリアルを所定の希釈液で組み合わせて、0.05 EU/mL の濃度で IEC を調製します。
4. 実験手順
   1. 約30分前に機器の電源を入れて、機器をウォームアップさせます。検出波長を660nmに設定し、濁度LALに適しています。
   2. ユーザー名とパスワードを入力してサインインします。
   3. ソフトウェア(資料表)を開くには、コンピューター画面上の対応するアイコンをクリックします。
   4. ソフトウェアのホーム画面で [データの収集] を選択します。テストIDとデータグループ情報を、ホーム画面の[一般]タブの対応するスペースに入力します。
   5. 「ハードウェア」タブをクリックし、ドロップダウンメニューからインストゥルメントのタイプを選択します。
   6. LAL濁度法を選択することにより、濁度LALに適した検出波長を660nmに設定します。
   7. シリアル番号、システムID、およびシリアルポート情報が画面に表示されていることを確認します。[OK] をクリックします。もう一度[OK]をクリックして確定します。
   8. サンプル ID は、サンプルがテストされるのと同じ順序で入力します。デフォルトのボタンを使用して、ネガティブコントロール、標準曲線、およびテストサンプルを入力します。
   9. 各サンプルに複製チューブを準備し、200 μL(試験比4:1)または100 μL(試験比1:1)のネガティブコントロール(水)、校正標準、品質管理、IEC、および試験用ナノ粒子を事前にラベル付けされたガラス管に加えます。
   10. 50 μL(試験比4:1)または100 μL(試験比1:1)のLAL試薬を最初の試験バイアルに加え、短時間ボルテックスして、機器カルーセルのテストスロットに挿入します。1:1の比率を使用する場合、LAL試薬の容量は100μLです。
   11. 他のサンプルについても、上記の手順を繰り返します。サンプルを一度に1つずつ処理します.
        

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
水酸化ナトリウム	シグマ	S2770	必要に応じて、サンプルのpHを6〜8に調整するために使用されます
塩酸	シグマ	H9892-J	必要に応じて、サンプルのpHを6〜8に調整するために使用されます
LAL試薬	ケープコッドの仲間	T0051	この試薬は、濁度アッセイでのみ使用できます
エンドトキシンスタンダードの制御	ケープコッドの仲間	E0005	この試薬は、濁度アッセイおよびゲル凝固アッセイで使用できます
LALグレードの水	ケープコッドの仲間	WP0501	この試薬は、任意のLAL形式で使用できます
グルカシールドバッファー	ケープコッドの仲間	GB051-25	ベータグルカンからの偽陽性反応を防ぐために使用
使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mm	ケープコッドの仲間	TB240	これらのチューブは、3つのアッセイすべてで使用できます
使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 8 x 75 mm	ケープコッドの仲間	TK100	これらのチューブは、濁度および発色アッセイで使用できます
パイロジェンフリーチップ 容量 0.25 mL および 1.0 mL	レイニン	PPT25、PPT10	チップやピペットはエンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため、使用されています
パイロジェンフリー微量遠心チューブ、2.0 mL	エッペンドルフ	22600044	他の同等の供給品を使用することができます
パイロジェンフィーコンビチップ 5mL	エッペンドルフ	30089669	他の同等の供給品を使用することができます
リピートピペッター	エッペンドルフ	4982000020	他の同等の供給品を使用することができます
マイクロセトリフュージ	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
冷蔵庫、2-8 C	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
渦動	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
冷凍庫、-20°C	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
Pyros Kinetix または Pyros Kinetix Flex リーダー	ケープコッドの仲間	PKF96	他の機器も使用できます。ただし、このアッセイで使用されるLAL試薬とエンドトキシン標準は最適化が必要な場合があります。他の機器を使用する場合は、機器およびLALキットの製造元に指示を参照してください

シリーズ の