Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay:ナノ粒子製剤中の細菌エンドトキシン検出法

要約

出典:Neun, B. W. et al., Detection of Endotoxin Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、カブトガニの血液細胞に由来するLimulus Amoebocyte Lysateを使用して、ナノ製剤中の細菌エンドトキシンの存在を決定するゲル凝固アッセイについて説明しています。このアッセイは、ナノベースの製剤を含む医薬品のエンドトキシン汚染の試験に役立ちます。

プロトコル

1. ナノ粒子試料の調製

1. LALグレードの水で研究サンプルを調製します。
2. サンプルのpHが6〜8の範囲外の場合は、パイロジェンフリーの水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用してpHを調整します。
3. LALグレードの水を使用して、研究サンプルを数回希釈します。最高希釈が最大有効希釈(MVD)を超えないようにしてください。

2. LALフォーマット間で共通の試薬の調製

1. パイロジェンフリーのLAL試薬水を使用して濃水酸化ナトリウムストックを希釈し、0.1 Nの濃度で作業溶液を調製します。
2. パイロジェンフリーのLAL試薬水を使用して濃塩酸ストックを希釈し、最終濃度0.1 Nの作業溶液を調製します。
3. コントロールスタンダードエンドトキシン(CSE)の調製
   1. メーカーから提供された分析証明書に従ってCSEを再構成します。
      手記：カタログ番号と、さまざまなLAL形式での特定のCSE製剤の適用に関する詳細については、材料表を参照してください。
4. LAL試薬の調製
   1. LAL試薬は、メーカーから提供された分析証明書に従って再構成します。
      手記：カタログ番号と、さまざまなLAL形式での特定のLAL試薬製剤の適用に関する詳細については、材料表を参照してください。

3.ゲルクロットLAL

>NOTE:このアッセイは、反応チューブ内の血栓の目視観察と検出に基づいて、サンプル中のエンドトキシンの存在を特定します。実験手順を以下に説明します。ベンチシートを使用して結果を記録します。このベンチシートは必須ではなく、アッセイ結果を記録する他の方法も許容されます。このようなベンチシートの例は、読者の便宜のために補足資料で提供されています。ラムダ(l)はゲル凝固アッセイの感度で、0.03 EU/mLです。

1. 分析された試験サンプルの数に対応するために必要な数の反応チューブにラベルを付けます。アッセイのステップ1、ステップ2、およびステップ3で使用した反復数の詳細については、ベンチシートを参照してください。
2. チューブあたり100μLの水、コントロール、または試験サンプルを分注します。
3. 最終濃度が4λに等しくなるようにCSEを準備します。
4. 上記の標準試料100 μLを100 μLの水または試験サンプルと組み合わせ、CSEの最終濃度2λを達成します。さらに 3 回繰り返して、ラムダ、ハーフ ラムダ、および 1/4 ラムダを達成します。
5. ウォーターバスの温度が37°Cであることを確認してください。
6. 試験管あたり100 μLのライセートを加え、短時間ボルテックスし、すべてのチューブが入ったラックをウォーターバスに1時間入れます。
7. 滑らかな動きでチューブを反転させます。
8. ベンチシートに「+」(固い血栓)または「-」(血栓がない、または血栓が緩んでいる)を使用して、結果を手動で記録します。
9. USP BET 85に従って分析を進めます。ベンチシートを補助材料として使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LAL試薬	ケープコッドの仲間	G5003	この試薬はゲル凝固アッセイに特異的です
エンドトキシン標準を制御する	ケープコッドの仲間	E0005	この試薬は、濁度およびゲル凝固アッセイで使用できます
水酸化ナトリウム	シグマ	S2770	必要に応じて、サンプルのpHを6〜8に調整するために使用されます
塩酸	シグマ	H9892-J	必要に応じて、サンプルのpHを6〜8に調整するために使用されます
LALグレードの水	ケープコッドの仲間	WP0501	この試薬は、任意のLAL形式で使用できます
グルカシールドバッファー	ケープコッドの仲間	GB051-25	ベータグルカンからの偽陽性反応を防ぐために使用
使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mm	ケープコッドの仲間	TB240	これらのチューブは、3つのアッセイすべてで使用できます
使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 10 x 75 mm	ケープコッドの仲間	TS050	これらのチューブは、ゲル凝固アッセイで使用するためのものです
パイロジェンフリーチップ 容量 0.25 mL および 1 mL	レイニン	PPT25、PPT10	チップやピペットはエンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため、使用されています
パイロジェンフリー微量遠心チューブ、2.0 mL	エッペンドルフ	22600044	他の同等の供給品を使用することができます
パイロジェンフィーコンビチップ 5mL	エッペンドルフ	30089669	他の同等の供給品を使用することができます
リピートピペッター	エッペンドルフ	4982000020	他の同等の供給品を使用することができます
マイクロセトリフュージ	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
冷蔵庫、2-8°C	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
渦動	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
冷凍庫、-20°C	どんなブランドでも		どんなブランドでも使えます
ウォーターバス、37°C	どんなブランドでも		どのブランドでも使用できますが、水の流れが血栓形成に影響を与え、偽陰性の結果につながるため、水の循環をオフにするか、非循環式のウォーターバスを使用することが重要です

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