発色性ポリマーハイドロゲルベースの酵素スクリーニングアッセイ:合成基質を使用して炭水化物活性酵素をスクリーニングするためのハイスループット法

要約

出典:Schückel, J., et al. 新規不溶性色素生成基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、不溶性発色性ポリマーハイドロゲル基質を用いた炭水化物活性酵素スクリーニングのハイスループットアッセイを実演します。酵素は、これらの基質を可溶性着色製品に分解し、製品の色の強度を測定することで定量化できます。

プロトコル

1. アッセイキットプレートの活性化

1. 96ウェルフィルター(青色CPH-キシランを含む)アッセイキットプレート(材料リスト)を活性化するために、200 μlの活性化溶液(キットで得られたもの)を各ウェルに加え、その後、攪拌せずに室温で10分間インキュベートします。
2. バキュームマニホールド(スペーサーブロックを内部に使用し、標準的な透明な96ウェルプレートをコレクションプレートとして使用)を使用して真空を適用し、既存の活性化溶液を除去します。このステップでは、真空マニホールドの代わりに2,700 x gの遠心分離機を10分間使用することも可能です。
3. 100 μlの滅菌水を加えてCPH基質を洗浄し、真空(または遠心力)を適用して安定剤を除去します。この手順をさらに2回繰り返すと、プレートを使用する準備が整いました。

2. 酵素反応

>注:常にバッファーのみをネガティブコントロールとして含め、可能であれば以前に特徴付けられた酵素をポジティブコントロールとして含めます。統計的に適切な数の反復を使用します。CPH基質はpH 3.0〜10.0の間で安定しており、各ウェル内のバッファー末端酵素溶液の総量は180μlを超えてはなりません。精製酵素溶液の代わりに植物抽出物や培養液を使用することもできます。

1. 150 μL 100 mM 酢酸ナトリウムバッファー、pH 4.5、および 5 μl のエンドセルラーゼ溶液 (最終濃度 1 U/mL) をアッセイキットプレートの各ウェルに加えます。
2. 製品プレート(マイクロタイタープレートリーダーに対応したクリアウェルプレート)をアッセイキットプレートの下に置き、振とう時に反応プレートから漏れる可能性のあるものを回収します。
3. アッセイキットプレートを25°Cで30分間、水平シェーカーで150rpmでインキュベートします.
   注:インキュベーション中にアッセイキットプレートで反応を混合することは、一貫性のある再現性のある結果を得るために重要です。CPH基板は90°Cまで安定しています。インキュベーション時間は、CPH基質で未知の酵素濃度を含む培養ブロスをテストする場合、最大24時間まで増やす必要があります。適切なインキュベーション時間は酵素の活性に依存しますが、一般的に、24時間以内に検出可能な活性がない場合、酵素は試験した基質を分解しない可能性が高いことに注意してください。活性酵素は、CPH基質の不溶性発色多糖類を可溶性発色オリゴ糖に分解しており、これは着色された上清として見えます。
4. クリーン製品プレートを真空マニホールドの内側に置き、スペーサーブロックを内側に置きます。
5. アッセイキットプレートを上に置き、真空(最大陰圧-60 kPa)を適用します。また、2,700 x gの遠心分離機を10分間
   で使用することも可能です。 注:反応生成物として着色されたオリゴ糖を含む濾液は、さらなる分析のために製品プレートに現在含まれています。

3. 検出と定量化

1. 製品プレートの各ウェル内の液体の量が目視検査でほぼ同じであることを確認してください。
2. プレートリーダーを使用して、青色CPH-キシランの595nmでの収集プレートの吸光度を読み取ります。
3. データ解析を行うときは、酵素を添加したウェルの値からバッファーのみのネガティブコントロール値を差し引きます。リピートウェルから平均値と平均の標準誤差(SEM)を計算します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アッセイキットプレート	グリコスポット		カスタマイズされたアッセイキットプレート
アクティベーションソリューション	グリコスポット		CPH基板の活性化用
真空マニホールド用350mlレシーバープレートスペーサーブロック	ポール・コーポレーション	5015	スペーサーブロック
96ウェルMultiScreen HVフィルタープレート、0.45 μm、透明、非滅菌	ミリポア	MSHVN4510	アッセイプレート
96ウェルマイクロプレート、ポリプロピレン	グライナーバイオワン	651201	基板洗浄後の収集プレート
Nunc MicroWell 96ウェルマイクロプレート	サーモサイエンティフィック	269620	製品プレート
ダイヤフラム式ポンプ MZ 2 NT	バキューブランド	732000	真空マニホールドと併用する真空ポンプ
インフォサーズHTエコトロン	インフォラーズHT	4950132(ブーフ&ホルム)	横型シェーカー
スペクトラマックス M5	分子デバイス	10067-750 (VWR)	96ウェルプレート吸光度リーダー
バキュームマニホールド	ポール・コーポレーション	5017	真空マニホールド
エンドセルラーゼ(EGII)(Trichoderma longibrachiatum)	メガザイム	E-CELTRの	セルラーゼ [CEL]
α-アミラーゼ(Bacillus licheniformis)	メガザイム	E-BLAAMの	アミラーゼ [エイミー]