不溶性発色バイオマス基底酵素スクリーニング:植物バイオマス分解酵素の分解活性を評価するためのアッセイ

要約

出典:Schückel, J., et al.新規不溶性発色基質アッセイキットを用いた炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、不溶性発色バイオマスまたはICBを使用して、植物バイオマス中の複雑な多糖類の分解に有効な酵素をスクリーニングするアッセイを示しています。酵素はICBを加水分解して可溶性色素結合オリゴ糖を放出し、酵素活性は反応生成物の比色分析によって評価されます。

プロトコル

1. ICB基質を用いた96ウェルフォーマットの発色アッセイ

1. 酵素反応
   1. 赤色ICB-麦わらを含むアッセイキットプレートの各ウェルに、150 μl 100 mM 酢酸ナトリウムバッファー (pH 4.5 および 5 μl 31 U/ml エンドキシラナーゼ溶液) を添加します (ウェル内の最終酵素濃度: 1 U/ml).
      手記：アッセイキットプレート(ICB基質を含む96ウェルフィルタープレート)は、文献に記載されているように製造されています(材料リストを参照)。ICB基質は、pH 3.0〜10.0のpH範囲の緩衝液中で安定です。常にバッファーのみをネガティブコントロールとして、市販の酵素をポジティブコントロールとして含め、統計的に適切な数のレプリカを使用してください。
      1. CPH基板プレートのようにICB基板を活性化するのではなく、100μlの水で3回洗浄した後、真空ろ過または遠心分離して安定剤を取り出します。
   2. 製品プレートを基板プレートの下に置き、振とう中に基板プレートから漏れる可能性のあるものを収集します。
   3. 反応液を25°Cで150rpmで2時間インキュベートします
      手記：活性酵素は、ICB基質中の不溶性発色多糖類を可溶性オリゴ糖に分解しており、これは着色された上清として見えます。ICB基板は90°Cまで安定です。培養液などの未精製酵素を使用する場合は、インキュベーション時間を最大24時間まで増やす必要があります。
   4. 製品プレートをバキュームマニホールドの内側に置き、スペーサーブロックを内側にします。
   5. アッセイキットプレートを上に置き、真空(最大負圧-60 kPa)を適用するか、遠心分離機を使用してアッセイキットプレートから製品プレートのウェルに製品をろ過します。
      手記：反応生成物として着色されたオリゴ糖を含むろ液は、さらなる分析のためにコレクションプレートに入れられています。

2. 検出と定量化

1. コレクションプレートの各ウェル内の液体の量が目視検査でほぼ同じであることを確認します。
2. プレートリーダーを使用して、赤色ICB-麦わらの517nmでの収集プレートの吸光度を読み取ります。
3. データ解析を行うときは、バッファーを差し引くと、酵素が添加されたウェルの値から負の制御値のみが得られます。複製ウェルから平均値と平均の標準誤差(SEM)を計算します.
   手記：未知の酵素をスクリーニングする場合は、酵素の活性のダイナミックレンジに関するより詳細なデータを得るために、希釈系列を作成することをお勧めします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アッセイキットプレート	グリコスポット		カスタマイズされたアッセイキットプレート
真空マニホールド用350mlレシーバープレートスペーサーブロック	ポール・コーポレーション	5015	スペーサーブロック
96ウェルMultiScreen HVフィルタープレート、0.45 μm、透明、非滅菌	ミリポア	MSHVN4510	アッセイプレート
96ウェルマイクロプレート、ポリプロピレン	グライナーバイオワン	651201	基板洗浄後の収集プレート
Nunc MicroWell 96ウェルマイクロプレート	サーモサイエンティフィック	269620	製品プレート
ダイヤフラム式ポンプ MZ 2 NT	バキューブランド	732000	バキュームマニホールドと併用するバキュームポンプ
インフォサーズHTエコトロン	インフォラーズHT	4950132(ブーフ&ホルム)	横型シェーカー
スペクトラマックス M5	分子デバイス	10067-750 (VWR)	96ウェルプレート吸光度リーダー
バキュームマニホールド	ポール・コーポレーション	5017	バキュームマニホールド
endo-β-1,4-キシラナーゼM4(Aspergillus niger)	メガザイム	E-XYAN4	キシラナーゼ[キシル]

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