示差核染色アッセイ:ヨウ化プロピジウムとヘキストの二重染色によるMitocan細胞毒性を決定するためのアッセイ

要約

出典: Pei, J. et al., An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、薬剤感受性がん細胞および健康な変異体に対するマイトカンの細胞傷害性効果を検出するための核染色法を示しています。ヨウ化プロピジウムやヘキスト色素などのDNA結合色素による二重染色により、死細胞と生細胞が明確に区別され、薬物の細胞毒性を評価するのに役立ちます。

プロトコル

1. 細胞毒性アッセイ:セットアップ

1. 目的の化合物の溶液を、適切な培地(無血清または1、2.5、または5%FBS RPMI-1640)で所望の濃度で調製します。
   1. 単一化合物の細胞毒性を測定するには(例えば、有効用量を決定するため)、最終濃度の2倍で化合物を調製します。
   2. 化合物の組み合わせの細胞毒性を測定するには、最終濃度の4倍で化合物を調製します。
   3. 溶媒のみのコントロールは、同量の溶媒を適切な媒体と混合して調製します。例えば、DMSOやメタノールに溶解した化合物を試験する場合は、溶媒ごとに溶媒のみの制御を行います。
2. 培養皿またはフラスコから細胞を15mLの円錐管に集めます。
3. 10 μLの細胞懸濁液を微量遠心チューブに移し、10 μL 0.4%トリパンブルーで染色します。血球計算盤を使用して、各細胞源の生存細胞と非生存細胞をカウントします。
4. 細胞を200gで5分間ペレット
化します。
5. アッセイに適した培地(無血清または1、2.5、5%FBS RPMI-1640)に細胞ペレットを細胞密度3*10⁵細胞/mL.
   で再懸濁します。 ノート1:細胞密度は3*10⁵細胞/mLで、播種密度は15,000細胞/ウェルです。播種密度は重要なパラメータであり、理想的には実験前に事前に定義する必要があります。播種密度は、1)セルサイズ–通常、より大きなセルは低い密度で播種されます。2)治療期間 - 通常、より長く続く実験のために細胞はより低い密度で播種され、3)細胞分裂率 - 分裂率の高い細胞はより低い密度で播種されます。最適化された播種密度の具体例:K562細胞、より大きく、24時間持続 – 10,000細胞/ウェル;MOLM-13細胞、中程度のサイズ、24時間処理 – 15,000/ウェル;MOLM-13細胞、48時間処理 – 8,000/ウェル;小さな健康な末梢血単核細胞(PBMC)、24時間治療– 50,000 /ウェル。初代AML細胞、24時間治療– 15,000-20,000 / well.
   ノート2:培地中のFBSの存在は、化合物の活性に影響を与える可能性があります。FBSの濃度を下げると、アッセイ結果の解釈が簡単になる可能性がありますが、生理学的精度も低下します。
6. ステップ1.5の細胞懸濁液50 μLを、マルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートの各ウェルに播種します。
7. 次のようにコンパウンドを追加します。
   1. 単一化合物アッセイの場合は、各ウェルに50 μLの2x化合物溶液を添加します。溶媒制御ウェルの場合は、溶媒を 2x 濃度で含む 50 μL の試験培地を加えます。
   2. コンビネーションアッセイでは、各化合物(4x溶液)を各ウェルに25 μL加えます。単一のコンパウンドコントロールウェルの場合は、25 μLの4倍コンパウンド溶液と25 μLの試験培地を加えます。溶媒制御ウェルの場合は、50 μLの試験培地または溶媒を含む試験培地を加えます
      ノート1:DMSOの最終濃度は0.5%を超えてはなりません.
      ノート2:化合物を含む培地は、ピペットが各ウェルの壁に触れるようにして添加することをお勧めします。
8. プレートを軽くたたいて、ウェルの内容物が混合されていることを確認します。
9. プレートを加湿した5%_CO2雰囲気で37°Cで適切な時間(例:24時間)インキュベー
トします。

2. 細胞毒性アッセイ:Hoechst 33342およびヨウ化プロピジウムによる染色

1. 10x染色液を調製します。この溶液は、各実験の前に新鮮に調製する必要があり、保存することはできません。最終的な色素濃度は、実験の前に決定する必要があります。
   1. 白血病細胞株および初代白血病細胞の場合、10x 染色バッファー 1 mL には、滅菌 PBS 中に 10 μL の 20 mM Hoechst 33342 と 50 μL の 1 mg/mL ヨウ化プロピジウムが含まれています (最終濃度: Hoechst 33342 20 μM、PI 5 μg/mL)。
   2. 健康なPBMCの場合、10x染色バッファー1 mLには、滅菌PBS中に20 mM Hoechst 33342 10 μLとヨウ化プロピジウム10 μLが含まれています(最終濃度:Hoechst 33342 20 μM、PI 1 μg/mL)
      手記： ヨウ化プロピジウムの最終濃度は、実験の前に決定する必要があります。細胞は、PI濃度の範囲(1、2.5、5 μg/mL)を使用して試験し、その後、Hoechst/PIで計算された生存率をトリパンブルーで測定した生存率と比較する必要があります。上記のPI濃度は、培地コントロールウェルでの標的細胞生存率に基づいて選択されました(白血病細胞株では~90%以上、健康なPBMCでは~70%以上)
      注意：Hoechst 33342およびヨウ化プロピジウムは、潜在的な発がん性物質です。それらを取り扱うときは、適切な個人用保護具を着用してください。
2. インキュベーション後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに10 μLの10倍染色バッファーを添加します
   手記： クロスコンタミネーションを防ぐため、ピペットチップがメディアに触れないようにしてください。
3. プレートを軽くたたいて泡を混ぜて取り除きます。37°Cで15分間染色します。
4. プレートを200 gで4分間遠心分離し、すべての細胞をプレートの底に持ってくる。広告でプレートの底を慎重に拭きますamp イメージングを妨げる繊維や破片を取り除くためのキムワイプ><。 ノート1:プレートを遠心分離することで、すべての細胞が画像に捕捉される可能性が高くなります。多くの場合、死んだ細胞は剥離して浮遊し、細胞毒性の誤解を招く値を提供します。遠心分離はこの影響を軽減します.
   ノート2:プレートは、遠心分離後できるだけ早く、理想的には15分以内にイメージングする必要があります。遠心分離はPI染色の選択性を低下させ、細胞がヨウ化プロピジウムをゆっくりと蓄積することを可能にする可能性があります。死細胞を可視化することで得られる精度の向上は、PI染色のわずかな増加を上回り
ます

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-デオキシ-D-グルコース/2-DG	ケムインペックス	〒50-519-067
3-ブロモ-ピルビン酸	アルファ・アエサル	1113-59-3
96ウェルプレート	グライナーバイオワン	655090	黒色または透明な平底96ウェルプレート
Countess II自動セルカウンター	サーモフィッシャー
Cytation 5 Cell Imaging マルチモードリーダー	ビオテック
ヘキスト33342	サーモフィッシャー	62249	20 mM溶液、最終濃度1:1,000
HyCloneウシ胎児血清	GEヘルスケア	#25-514
m-クロロフェニルヒドラゾン/CCCP	シグマ・アルドリッチ	C2759
PBSタブレット	サーモフィッシャー	BP2944100	1錠+滅菌水200mL=PBS溶液1個
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(100X)	ギブコ	10378016
ヨウ化プロピジウム	サーモフィッシャー	〒50-596-072	乾燥粉末;PBSに1 mg/mLをストック;最終濃度5 μg/mL(白血病細胞)、1 μg/mL(正常PBMC)
ロテノン	アークファーム	AK115691
RPMI-1640培地L-グルタミンと重炭酸ナトリウム、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適しています	シグマ・アルドリッチ	R8758-500ミリリットル
トリパンブルーステイン(0.4%)	ギブコ	15250-061
細胞株
K562	ATCCの	CCL-243	CML細胞株
モール-13	ATCCの		AML細胞株
モルト-4	ATCCの	CRL-1582	ALL細胞株
OCI-AML2	ATCCの		AML細胞株