溶血アッセイ:ヒト赤血球中のカルシウムイオノフォア誘発溶解を測定するためのIn vitro法

要約

出典:Bigdelou, P. et al., Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、ヒトサンプル中のカルシウムイオノフォア誘発溶血または赤血球の溶解を測定するためのin vitroアッセイについて説明しています。このアッセイは、破裂した赤血球から放出されるヘモグロビンを定量化することにより、溶血の割合を測定します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 全血からの赤血球の単離

1. 酸性クエン酸デキストロース(ACD)(4°Cで保存)中の全血500μLを微量遠心チューブに加えます
   手記：ACDで全血を購入しました。同社によると、全血7mL(総量8.5mL)にACD1.5mLを添加するとのこと。
2. 全血を700 x gで室温(RT)で5分間遠心分離し、透明な血漿と薄いバフィーコートをピペットで除去して赤い赤血球層を残します。
3. 125 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO₄、32 mM HEPES、5 mM グルコース、および1 mM CaCl₂を含む1 Lのリンゲル溶液を調製します。1.0 M NaOHを2 μL滴加えて、pHを7.4に調整します。グルコースフリーのリンゲル溶液を調製するには、同じプロトコルに従いますが、溶液にグルコースを含めないでください。
4. 赤血球をRinger溶液1.5 mLに細胞ペレットを懸濁し、室温で700 x gで5分間遠心分離し、上清を除去して、赤血球をRinger溶液で2回洗浄します。
5. 赤血球ペレット40 μLをグルコースフリーRinger溶液9,960 μLに再懸濁して、最終容量10 mLに到達し、0.4%ヘマトクリットを作製します>< 手記：ヘマトクリットは、懸濁液中の赤血球の体積分率を指すために使用される用語です。0.4%ヘマトクリットは、0.4%の赤血球を含む懸濁液です。
6. 細胞懸濁液を37°Cで7日間インキュベートします。

2. イオノマイシンによる赤血球の治療と溶血の測定

1. 1 mgのイオノマイシンカルシウム塩を630 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、最終濃度2 mMにします。分注して-20°Cで保存します。
2. ステップ1.5の0.4%ヘマトクリット液1 mLを摂取し、0.5 μLの2 mMイオノマイシンを添加して最終濃度1 μMにします。
   1. イオノマイシン処理なしのヘマトクリット1mLをネガティブコントロールとして使用します。.
3. イオノマイシン処理および未処理のヘマトクリットを700 x gでRTで5分間遠心分離し、それらの上清を除去して細胞ペレットをチューブの底に残します。
4. 細胞ペレットを1.5 mLのRinger溶液に懸濁し、室温で700 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄することにより、細胞をRinger溶液で3回洗浄します。
5. 溶血を測定するには、ステップ1.5の未処理の0.4%ヘマトクリット液1 mLを微量遠心チューブに加え、溶血の陰性コントロール(0%)として37°Cで2時間インキュベー
トします。
6. ステップ1.5の未処理の0.4%ヘマトクリット値1 mLを微量遠心チューブに加え、室温で700 x gで5分間遠心分離します。上清を除去し、1 mLの蒸留水を細胞ペレットに加え、溶血の陽性コントロール(100%)として37°Cで2時間インキュベー
トします。
7. ステップ2.2のイオノマイシン処理0.4%ヘマトクリット液1mLを微量遠心チューブに加えます。
8. 未処理の細胞、処理した細胞、および蒸留水中の細胞を700 x gで室温で5分間遠心分離します。
9. 200 μLの上清を取り出し、96ウェルプレートに加えます。
10. マイクロプレートリーダーを使用して541nmでの吸光度を測定します。
11. 式1:
    を使用して溶血を計算します 溶血率 = (A_T - A₀)/(A₁₀₀ - A₀)*100
    ここで、A₀はリンゲル溶液中の赤血球の吸光度、A₁₀₀は水中の赤血球の吸光度、ATはイオノマイシンによる処理された赤血球の吸光度です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-331
CaCl2	フィッシャーサイエンティフィック	C79-500
遠心機	ミリポアシグマ	M7157	モデル Eppendorf 5415C
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	472301から100ミリリットル
グルコース・モノハイドレート	シグマ・アルドリッチ	Y0001745
HEPESバッファー(1 m)	フィッシャーサイエンティフィック	〒50-751-7290	4°Cで保存
イオノマイシンカルシウム塩	EMDミリポア株式会社	407952から1MG	DMSOに溶解して2 mMに到達します。-20°Cで保存
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	P330-500
MgSO4	フィッシャーサイエンティフィック	M65-500
マイクロ遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	02-681-5
NaCl	フィッシャーサイエンティフィック	S271-500
Synergy HFM マイクロプレートリーダー	ビオテック
ACDの全血	ゼンバイオ		4°Cで保存し、37°Cまで温めてから使用してください

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