アネキシンV結合アッセイ:ホスファチジルセリン標識を介してアポトーシス赤血球を同定する蛍光ベースの技術

Abstract

出典: Bigdelou, P., et al. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、蛍光アネキシンV染色を使用して、赤血球プログラム細胞死である紅葉症の程度を測定するアネキシンV結合アッセイを実演します。アポトーシス赤血球は、細胞膜の内側から外側のリーフレットへのホスファチジルセリン転座を示し、フルオロフォアタグ付きアネキシンVが転座したホスファチジルセリンに結合し、それによって蛍光シグナルを放出します。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. Annexin-V結合アッセイ

1. 1 mgのイオノマイシンカルシウム塩を630 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、最終濃度2 mMにします。分注して-20°Cで保存します。
2. 0.4%ヘマトクリット液1mLを採取し、2 mMイオノマイシン0.5 μLを添加して最終濃度1 μMにしてください。
3. イオノマイシン処理および未処理のヘマトクリットを700 x gでRTで5分間遠心分離し、それらの上清を除去して細胞ペレットをチューブの底に残します。
4. 細胞ペレットを1.5 mLのRinger溶液に懸濁し、室温で700 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄することにより、細胞をRinger溶液で3回洗浄します。
5. イオノマイシン処理および未処理の赤血球細胞ペレットを1 mLの1x結合緩衝液に再懸濁します。
6. 5x annexin V結合バッファー2 mLを8 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して、1x結合バッファーを得ます。
7. 結合バッファー中の細胞懸濁液235 μLを取り出し、Annexin V-Alexa Flour 488コンジュゲート15 μLを加えます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - アポトーシスキット	フィッシャーサイエンティフィック	A10788 (英語)	4°Cで保存
BD FACSAria II フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	643177
イオノマイシンカルシウム塩	EMDミリポア株式会社	407952から1MG	DMSOに溶解して2 mMに到達します。-20°Cで保存
遠心機	ミリポアシグマ	M7157	モデル Eppendorf 5415C
使い捨て丸底フローサイトメトリーチューブ	VWRの	VWRU47729-566
CaCl2	フィッシャーサイエンティフィック	C79-500
DPBSの	VWRライフサイエンス	02 SH30028月
マイクロ遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	02-681-5
ACDの全血	ゼンバイオ		4°Cで保存し、37°Cまで温めてから使用してください