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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. Annexin-V結合アッセイ
- 1 mgのイオノマイシンカルシウム塩を630 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、最終濃度2 mMにします。分注して-20°Cで保存します。
- 0.4%ヘマトクリット液1mLを採取し、2 mMイオノマイシン0.5 μLを添加して最終濃度1 μMにしてください。
- イオノマイシン処理および未処理のヘマトクリットを700 x gでRTで5分間遠心分離し、それらの上清を除去して細胞ペレットをチューブの底に残します。
- 細胞ペレットを1.5 mLのRinger溶液に懸濁し、室温で700 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄することにより、細胞をRinger溶液で3回洗浄します。
- イオノマイシン処理および未処理の赤血球細胞ペレットを1 mLの1x結合緩衝液に再懸濁します。
- 5x annexin V結合バッファー2 mLを8 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して、1x結合バッファーを得ます。
- 結合バッファー中の細胞懸濁液235 μLを取り出し、Annexin V-Alexa Flour 488コンジュゲート15 μLを加えます。
- 細胞を室温(RT)で20分間、暗所でインキュベートします。700 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 細胞ペレットを1.5 mLの結合バッファーに懸濁し、室温で700 x gで5分間遠心分離し、上清を除去して、1x Binding Bufferで細胞を2回洗浄します。
- 細胞ペレットを250 μLの1x結合バッファーに再懸濁して、フローサイトメトリー測定に用いてください。
2. フローサイトメトリー
- アネキシンV染色赤血球200 μLを、フローサイトメトリーに適合した1 mLの丸底ポリスチレンチューブに移します。
- フローサイトメトリーソフトウェアにログインし、新しい実験ボタンをクリックします。新しいチューブボタンをクリックします。グローバルシートを選択し、励起波長488 nm、発光波長530 nmの蛍光強度を測定するための適用解析を選択します。
- 蛍光活性化セルソーティング(FACS)解析のために収集する細胞の数を20,000に設定します。
- 目的のチューブを選択し、ロードボタンをクリックします。前方散乱と側方散乱の測定には、記録ボタンをクリックします。すべてのサンプルについて繰り返します。
- 試料ボタンを右クリックし、バッチ解析の適用をクリックして結果ファイルを生成します。
- 標本ボタンを右クリックし、FSCファイルの生成をクリックします。