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>注:読者の方の参考として、以下の方法論では、バイオアッセイの実行における20の実験サンプルからのFeバイオアベイラビリティの測定に必要な特定の培養条件と材料、および必要な品質管理について説明しています。この容量を超えてサンプル数を増やすことは、バイオアッセイ内のさまざまな細胞培養やin vitro消化ステップに時間がかかるため、推奨されません。
1. サンプル量の選択
- 固体または液体の食品の場合、試験するサンプルを代表すると考えられる食品の量を決定します。
- 豆品種のFeバイオアベイラビリティの試験では、100〜150 gの豆の種子を使用し、この量を均質なサンプルに処理します。
- 強化ジュース、乳製品、スポーツ飲料などの液体サンプルの場合は、サンプリング前に食品が十分に混合されていることを確認してください.
注:上記の豆種子材料の量は、この主食作物の種子間の固有の違いを説明するために不可欠です。
2. サンプルの準備
- 処理する前に、食品サンプルの土壌とほこりを蒸留脱イオン水で洗い流してください。
- 実験目的に応じて、調理法や粉砕法などにより適切な量のサンプルを処理します.
注意: 調理と加工には、汚染物質Feの潜在的な発生源ではない調理器具や機器を使用することが重要です。ステンレス製の機器は汚染しません。ただし、石臼グラインダー、鋳鉄製の調理器具、およびFeを含む非ステンレス鋼の機器などの機器は、大量の汚染物質Feを追加する可能性があります。標準的なステンレス製のコーヒーグラインダーは、多くの場合、粉砕に適しています。
- 凍結乾燥し、均質な粉末に粉砕します.
注:均質化されると、研究により、測定される各食品に対して分析の3つの独立した複製が適切であることが示されています。
- サンプルの均質性を達成するのが難しい場合は、製品の配合または処理を修正してください。これが不可能な場合は、非均質性が深刻でない場合はレプリケーションを追加します。
- ほとんどの均質な固形食品では、1回の複製につき0.5 gの凍結乾燥サンプルを使用します。必要に応じて、1回の繰り返しにつき最大1.0 gのサンプルを使用しますが、0.5 gを超えると応答の程度にメリットがあるかどうかを確認します
注:固形食品が0.5 gを超えると、透析膜が詰まる可能性があります(以下を参照)。
- 1〜2 mLの液体サンプルを使用します
手記：液体サンプルには凍結乾燥が必要ないことがよくあります。
3. Caco-2細胞培養
- ストックカルチャー
- 認定サプライヤーからCaco-2細胞を入手してください。
- 25 mM HEPES(pH 7.2)、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、および1%抗生物質-抗真菌溶液を添加したDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)を使用して、5% CO2空気雰囲気(一定湿度)のインキュベーターでストックバイアルから細胞を37°Cで培養します。
- 十分な細胞が利用可能になったら、通常は培養の7〜10日後に、コラーゲンコーティングされていないフラスコに細胞を30,000細胞/cm2の密度で播種します。
- マルチウェルプレートの播種に利用可能で必要なセルの数に応じて、フラスコのサイズを選択してください.
注:一般に、T225(225 cm2)フラスコは、バイオアッセイごとに11枚のマルチウェル(6ウェル、9.66 cm2/ウェル)プレート(サンプル比較用に10枚、品質管理用に1枚)を使用する実験に最適です。
- フラスコで7日間細胞を増殖させ、1日おきに培地を交換し、7日目にマルチウェルプレートの播種に使用します
注:細胞がストック培養から開始され、その後一連の実験で使用されるときから10〜15継代以下の継代範囲を使用することをお勧めします。細胞培養の継代は、広範囲の継代が細胞株の適応変化をもたらし、したがってモデルの応答にばらつきをもたらす可能性があるため、制限する必要があります。
- マルチウェルプレートでの細胞培養
- Caco-2細胞を50,000細胞/cm2の密度で6ウェルコラーゲンコーティングプレートに播種します
注:この手順は通常、水曜日に行うと最適に機能します。次の手順で、この曜日が最適な理由が明らかになります。
- DMEMに25 mM HEPES(pH 7.2)、10%(v/v)FBS、および1%抗生物質-抗真菌溶液を添加したDMEMを使用して、5% CO2空気雰囲気(一定湿度)のインキュベーターで37°Cで12日間細胞を増殖させます
注:細胞単層を12日以上培養すると、細胞が過剰増殖する可能性があります。これまでの研究では、これらの条件下では、播種後12日で、細胞単層は成熟し、プレートにしっかりと付着し、応答の一貫性が最適であることが明確に示されています。細胞を最長19〜21日など長く増殖させると、細胞の過剰増殖が起こり、培地の栄養素が急速に枯渇し、不健康な単層が生じます。
- 12日間の期間中は、少なくとも2日ごとに、一貫した毎日のスケジュールで媒体を変更します。
- 播種後12日目に、培地を2 mLのMinimum Essential Medium(MEM [pH 7])に10 mM PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス-[2-エタンスルホン酸])、1%抗生物質-抗真菌溶液、ヒドロコルチゾン(4 mg / L)、インスリン(5 mg / L)、セレン(5 μg / L)、トリヨードチロニン(34 μg / L)、および上皮成長因子(20 μg / L)を補充した最小必須培地(MEM [pH 7])と交換します><
注:シードが水曜日に開始された場合、12日目は月曜日になります。
- 翌日(つまり、13日目)に、MEMを取り外し、1 mLのMEM(pH 7)と交換します
注:この手順は火曜日に行われます。この日はバイオアッセイが始まる日です。したがって、13日間のスケジュールは、一貫した週次スケジュールの利点をもたらし、バイオアッセイを同じ平日に一貫して実施することができます。
4. 体外消化
- インサートリングの準備
- 酸洗浄透析膜を取り付けたシリコンOリングを使用して滅菌インサートリングを作成します(図1A).
注:バイオアッセイの日の1日前(つまり、月曜日、12日目)にインサートを準備し、使用する準備ができるまで18MΩの水に4°Cで保存します。
- バイオアッセイ当日(13日目火曜日)に、インサートを冷蔵庫から取り出し、水を切り、水を0.5 M HClと交換します。室温で層流フードに少なくとも1時間置いてから使用してください。
注:この手順は、培養プレートからMEMを取り外す前に実行する必要があります。メンブレンの酸洗浄は、汚染の可能性のあるFeを除去し、インサートリングとメンブレンを滅菌するのに役立ちます。
- インサートから0.5 M HClを排出し、滅菌済みの18 MΩ水ですすいでください。使用する準備ができるまで、室温で滅菌18MΩの水に層流フードで保管します。
- Caco-2細胞を搭載した6ウェルプレートの各ウェルにリングを挿入し、2チャンバーシステムを構築します。インサート付きのプレートをインキュベーターに戻します.
注:このステップは、新鮮な1.0 mLのMEMを各ウェルに添加した直後に実行する必要があります(ステップ3.2.5を参照)。
- ペプシン溶液の調製
- 実験当日、0.145 gのペプシンを50 mLの0.1 M HClに溶解してペプシン溶液を調製し、溶液をプラットフォームシェーカーで室温で30分間静かに振ってください。
- パンクレアチン-胆汁溶液の調製
- 実験と同じ日に、2.1 gのNaHCO3を250 mLの18 MΩ水に溶解して、0.1 M NaHCO3を調製します。
- 0.35 gのパンクレアチンと2.1 gの胆汁抽出物を175 mLの0.1 M NaHCO3に混合します。
- パンクレアチンと胆汁抽出物が可溶化されたら、87.5 gの弱陽イオン交換樹脂(材料表を参照)を加え、室温で30分間振とうして混合します。
- スラリーを大きなカラムに注ぎ、溶出液を収集します。
- さらに 70 mL の 0.1 M NaHCO3 でカラムを溶出し、この容量をパンクレアチン胆汁溶液に集めます
注:樹脂の目的は、パンクレアチン胆汁抽出物に一般的に見られる汚染物質Feを除去することです。
- in vitro消化を開始します。
- 滅菌済みの50 mL遠心チューブ(ポリプロピレン)でサンプルを秤量し、続いてpH 2で140 mM NaClおよび5 mM KClを含む生理食塩水10 mLを添加します。
- 調製したブタのペプシン溶液0.5 mLをサンプルに添加して胃消化プロセスを開始し、ロッキングシェーカーで37°Cの1時間、低く穏やかな設定でインキュベー
トします。
- この期間の後、1.0 M NaHCO3でpHを5.5-6.0に調整することにより、各サンプルの腸消化プロセスを開始します。
- 各サンプルチューブに2.5 mLのパンクレアチン胆汁溶液を加え、1.0 M NaHCO3でpHを6.9〜7.0に調整します。
- pHを調整したら、140 mM NaCl、5 mM KCl(pH 6.7)溶液を使用して各チューブ内の容量を均等化し、目標値を15 g.
でチューブの重量を測定します。
注:一部の食品では、食品の緩衝能力に応じて、総容量を16gまたは17gにする必要がある場合があります。
- 各腸消化物1.5 mLを、Caco-2細胞を含む6ウェル培養プレートの対応するウェルの上部チャンバー(すなわち、透析膜のあるインサートリングを含む)に移します(図1B)。
- プレートカバーを元に戻し、37°C(5% CO2空気雰囲気)でロッキングシェーカー上で6振動/分で2時間インキュベートします。
- ダイジェストの入ったインサートリングを取り外し、各ウェルにさらに1 mLのMEM(pH 7)を加えます。
- 細胞培養プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2空気雰囲気)にさらに22時間戻します。
- 22時間後、細胞培養培地を取り出し、細胞単層に2.0mLの18MΩ水を加えます
注:水は細胞を浸透圧的に溶解します。
- 細胞全体のライセートを標準的なポリプロピレン製微量遠心チューブなどに回収し、その後の細胞タンパク質および細胞フェリチン分析に使用します。
