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>注:すべての手順は、ブロワーをオンにし、照明をオフにしたクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
1. 材料の準備
>注:すべての材料は材料の表に記載されています。
- 培地1、遠心分離用培地2、および蛍光2-デオキシ-2-[(7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]-D-グルコース(2-NBDGまたはFD-グルコース)の保管および作業溶液を、クラスIIバイオセーフティキャビネットに表1に従って調製します。実験中は、ボンネットの下のすべての照明をオフにして、FD-グルコースを光から保護します。
- すぐに使用できる細胞培養試薬:トリプシン-EDTA、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、グルコースフリーおよびフェノールレッドフリーのDulbecco's Modified Eagle Medium(以下、グルコースフリーDMEM)を使用してください。
- 20 mLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーを使用します.
注:次のセクションでは、インスリン刺激の有無にかかわらず、3T3-L1線維芽細胞における異なるFD-グルコース用量の細胞外枯渇と細胞内取り込みを比較します(図1)。
2. 3T3-L1細胞の培養とメンテナンス
- 20 mLの培地1で希釈した1 x 106細胞を2つの96ウェルプレートにプレーティングすることにより、3T3-L1マウス線維芽細胞を培養します。ウェルあたり100μLの細胞懸濁液をプレートに取り、混合することによりこの懸濁液の均一性を維持します。37°Cのインキュベーター(5%CO2および95%湿度)で、培地を交換せずに48時間細胞を増殖させ、約70%〜80%のコンフルエントになるまで
培養します。
- 細胞をコンフルエントに保ち、同じ培地で48時間培養することにより、インキュベーション時間を所望の空腹時異化状態に応じて24〜72時間から変化させます。
3. 3T3-L1細胞の飢餓
- 96ウェルプレートの細胞から培地をデカントします。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。
- 96ウェルプレートをウェルあたり100 μLのPBSですすぎ、滅菌ペーパータオルで残りの液体を吸収します。
- ウェルあたり100 μLのグルコースフリーDMEMを添加し、40分間インキュベートします。細胞の種類、刺激、および希望する空腹時レベルに応じてインキュベーション時間を調整します。
注:インキュベーションの時期は、季節によっては最適化が必要な場合があります。
4. 異なる濃度のFD-グルコース溶液の調製
>注:図1の実験では、インスリンによる刺激がある場合とない場合の細胞外および細胞間培地を調べています。
- 各刺激条件に対して8回の繰り返し(96ウェルプレートの1行)を使用します。したがって、各刺激条件(表2以下に指定)ごとに1 mLを調製します。
- インスリンを含まない8つの刺激条件を使用します:2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg /mL(FD-グルコースなしのコントロール)のFD-グルコースを1つの96ウェルプレートで
。
- インスリン(10 μg/mL、最終濃度)で8つの刺激条件を使用します:FD-グルコース2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースなしのコントロール)を別の96ウェルプレートで。
- 刺激条件を調製するには、5 mg/mL FD-グルコース作動溶液 1 μL (表 1) を 999 μL のグルコースフリー DMEM で希釈して、1 mL の作動ストック溶液 (1:1000 希釈または 5 μg/mL) を得ます。
- このワーキングストック溶液を使用して、1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000、および1:100,000のFD-グルコースを調製し、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、および0.05 μg/mL(表2)を2 mLチューブで、照明のないバイオセーフティキャビネットで
取得します。
- ステップ4.4を繰り返し、上記の各条件に1μLのインスリン(10 mg / mL、最終濃度)を追加します。
注:これらのサンプル中のインスリンの最終濃度は10μg / mL = 1.7 nmol / mLです。.均質化を実現するには、他の溶液を追加する前にチューブにインスリンを追加します。
5. 飢餓状態の3T3-L1細胞の治療
- インキュベーションの40分後、96ウェルプレートで各ウェルからグルコースフリーDMEMをデカントし、滅菌ペーパータオルで残りの液体を吸収します。
- 上記のさまざまな処理条件からそれぞれ100 μL(ウェルあたり)を1列のウェルに添加し、同じ処理条件から100 μL(ウェルあたり)を両方の96ウェルプレートの列に沿ってウェル(8回繰り返し)に添加します。インスリンの有無にかかわらず、条件を利用したプレートにラベルを付けます。グルコースフリーDMEMのみをコントロールウェル(n = 8)に添加します。
- プレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)で暗所で40分間インキュベートします。
6. 刺激された3T3-L1細胞の細胞外および細胞間測定
- 細胞を40分間刺激した後、両方のプレートから刺激媒体を新しい96ウェルプレートに移し、同じ実験レイアウトを維持します。
- 元の刺激された96ウェルプレートから残っている溶液を、滅菌ペーパータオル上の細胞でデカントします。
- 必要に応じて、PBSで細胞を洗浄します。PBSを取り除き、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。
- 各ウェルに100 μLのRIPA溶解バッファーを添加します。オプションで、プロテアーゼ阻害剤をRIPAバッファーに添加してタンパク質を保護します。RIPAを含むプレートをシェーカーに30分間置きます。
- マイクロプレートリーダー(Table of Materials)を使用して、細胞外FD-グルコースを含む培地で、それぞれ485 nmおよび535 nmの励起(Ex)および発光(Em)波長で蛍光を測定し、次に30分間のインキュベーション終了時にRIPA溶解細胞をプレートで測定します(ステップ6.4を参照)。
>表1:培地とFD-グルコース溶液の調製。
。
してください。
| ソリューション/メディウム | コンポーネント |
| エタノール:DMSO(1:1/v/v) | エタノール(200 μL)およびDMSO(200 μL)を1-1.5 mLチューブに入れ、細胞培養グレードのエタノールおよびDMSOを使用 |
| ミディアム1 | DMEM (89 mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) (1 mL)、およびウシ血清 (10%) (10 mL) を滅菌 50 mL チューブに入れました |
| 遠心分離媒体2 | DMEM (89 mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) (1 mL)、ウシ血清 (10%) (10 mL) を滅菌 50 mL チューブに入れました |
| 保存用FD-グルコース溶液 5 mg/mL (14.5 mM) | FD グルコース (1 mg) およびエタノール:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) 0.5 mL チューブ内; -80 °C で保存し、アルゴンまたは窒素雰囲気下で優先的に保存 |
| 作業用FD-グルコース溶液 5 μg/mL (14.5 mM) | FDグルコース溶液5 mg/mL(1 μL)、グルコースフリーDMEM(999 μL)を保存;実験の直前に調製します。 |
>表2:図1に示す実験のための異なる濃度のFD-グルコース溶液の調製。
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
| 希釈 | コントロール | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1×104 | 1:2.5×104 | 1:5x104 | 1:1×105 |
| 濃度(μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| グルコースフリーDMEM(μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FDグルコース 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
