細胞外蛍光グルコースアナログ枯渇の測定:マウス臓器におけるグルコース取り込みをex vivoで評価するための代理測定技術

要約

出典:Kumar, S. B. et al., Intracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo.J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、採取したマウス臓器の細胞外グルコースアナログ枯渇を測定するex vivo技術を示しています。これは、蛍光標識されたデオキシグルコースを含む溶液でマウス組織をインキュベートし、細胞に取り込まれることを含みます。グルコースアナログの取り込みは、インキュベートされた培地の蛍光を測定することによって間接的に決定できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>注:すべての手順は、ブロワーをオンにし、照明をオフにしたクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。

1. 材料の準備

>注:すべての材料は材料の表に記載されています。

1. 培地1、遠心分離用培地2、および蛍光2-デオキシ-2-[(7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]-D-グルコース(2-NBDGまたはFD-グルコース)の保管および作業溶液を、クラスIIバイオセーフティキャビネットに表1に従って調製します。実験中は、ボンネットの下のすべての照明をオフにして、FD-グルコースを光から保護します。
2. すぐに使用できる細胞培養試薬:トリプシン-EDTA、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、グルコースフリーおよびフェノールレッドフリーのDulbecco's Modified Eagle Medium(以下、グルコースフリーDMEM)を使用してください。

2. 臓器における細胞外FD-グルコース枯渇の生体外測定

1. 臓器解剖の前に、以下のように、マウスをグルコース代謝を刺激する化合物で前処理します。
2. 9週齢のLep^ob雄マウス(n = 11)を使用します。実験前に、すべてのマウスに定期的なチャウダイエットを与えてください。
3. マウスを腹腔内(i.p.)注射の3つのグループにランダムに割り当てます。
   1. コントロールLep^ob群のマウスに0.1 mLの滅菌PBS(n = 4)を注入します。
   2. インスリンLep^ob群のマウスに、体重(BW)1グラムあたり12IUのヒトインスリンを含む0.1mLの滅菌PBSを注射します(n = 3)。
   3. AAC2 Lep^ob グループのマウスに、体重 (BW) 1 グラムあたり 0.1 nmol の AAC2 を含む 0.1 mL の滅菌 PBS を注入します (n = 4)。
4. 15分後、マウスに5%イソフルランを吸入し、麻酔動物から心臓穿刺により血液を抜血します。
5. 各動物の内臓上顐巣性白色脂肪組織(200 mg)、肝臓(200 mg)、および全脳を解剖します。.ティッシュの取り扱いには、クラスIIのバイオセーフティフードを使用してください。
6. グルコースフリーDMEM中のFD-グルコース(0.29 mM)作業溶液を、光のないクラスIIバイオセーフティキャビネットで調製します。
7. マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長が485 nmと535 nmの励起波長と発光波長がそれぞれ485 nmと535 nmのFD-グルコースワーキング溶液(0.29 mM)の蛍光を測定します。
8. 採取した組織/臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベー
トします。
9. 1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置いてPBSを吸収します。組織/臓器を4,000 μLのグルコースフリーDMEMを含む別の6ウェルプレートに移し、2分間インキュベートします。
10. 2分後、組織を取り出し、0.29 mM FD-グルコースワーキング溶液(1 mL/ウェル)を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6ウェルプレートをFD-グルコース作業溶液中で37°C(5%CO₂および95%湿度)でインキュベートします。
11. 0分、10分、20分、30分、40分、60分、90分、120分のインキュベーション後に各ウェルから100 μLのFD-グルコースワーキング溶液を採取し、細胞外FDグルコース枯渇の動態を分析します。収集の前後に振ってください。
12. 100 μLのFD-グルコースワーキング溶液を96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長485 nmおよび発光波長535 nmの蛍光を測定します。
13. 各動物の各臓器の蛍光を0分値(100%)に正規化します(図1)。

>表1:培地とFD-グルコース溶液の調製。

。 してください。

ソリューション/メディウム	コンポーネント
エタノール:DMSO(1:1/v/v)	エタノール(200 μL)およびDMSO(200 μL)を1-1.5 mLチューブに入れ、細胞培養グレードのエタノールおよびDMSOを使用
ミディアム1	DMEM (89 mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) (1 mL)、およびウシ血清 (10%) (10 mL) を滅菌 50 mL チューブに入れました
遠心分離媒体2	DMEM (89 mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) (1 mL)、ウシ血清 (10%) (10 mL) を滅菌 50 mL チューブに入れました
保存用FD-グルコース溶液 5 mg/mL (14.5 mM)	FD グルコース (1 mg) およびエタノール:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) 0.5 mL チューブ内; -80 °C で保存し、アルゴンまたは窒素雰囲気下で優先的に保存
作業用FD-グルコース溶液 5 μg/mL (14.5 mM)	FDグルコース溶液5 mg/mL(1 μL)、グルコースフリーDMEM(999 μL)を保存;実験の直前に調製します。

結果

図1:さまざまな臓器における細胞外FD-グルコース枯渇の動態ex vivo.(A-C)Lep^obマウスに、ビヒクル(PBS、n = 4)、インスリン(12 IU/kg BW、n = 3)、およびAAC2(1 nmol/g BW、n = 3)を注射しました。15分後、組織を解剖し、単離した。(A)内臓脂肪、(B)肝臓、および(C)脳の外植片をFD-グルコース(0.29 mM)でインキュベートした。細胞外グルコース枯渇の動態は、さまざまな時点で培地のアリコートで測定されました。データ(平均SD)は、インキュベーション0分での各臓器の蛍光の%として示されています。有意性P<0.05、対応のないt検定。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	隼	353227	プラスチック製品
B6です。V-Lepob/J雄マウス	ジャクソン研究所	品番 000632	マウス
BioTek Synergy H1 モジュール式マルチモード マイクロプレート リーダー (Fisher Scientific、米国)	フィッシャーサイエンティフィック、米国	フィッシャーサイエンティフィック、米国	デバイス
細胞インキュベーター	フォーマ	シリーズIIウォータージャケット	デバイス
ダイエット(マウス/ラットダイエット、照射)	エンビゴ	テクラッドLM-485	ダイエット
イソフルラン、5%	ヘンリー・シャイン	NDCの11695-6776-2	麻酔薬
リン酸緩衝液	シグマ・アルドリッチ	DA537-500ミリリットル	細胞培養
ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)	Gibco/サーモフィッシャー	15140-122	細胞培養
グルコースフリーおよびフェノールレッドフリーDMEM	Gibco/サーモフィッシャー	A14430-01	細胞培養
蛍光 2-デオキシ-2-[(7-ニトロ-2,1,3- ベンゾオキサジアゾール-4-イル) アミノ]-Dグルコース)	シグマ	72987から1MG	試験
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	Gibco/サーモフィッシャー	11965-092	細胞培養
ウシ血清	Gibco/サーモフィッシャー	161790から060	細胞培養
エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023-500mL	試薬