In VitroでのSMC収縮の測定:電気細胞-基板インピーダンスセンシングを使用して平滑筋細胞の収縮を評価するための非侵襲的方法

要約

出典:Bogunovic, N. et al., Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、ECIS(Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing)を使用した大動脈平滑筋細胞(SMC)の収縮の測定について説明しています。ECISは細胞の運動を測定し、収縮を測定するための信頼性の高い方法です。

プロトコル

人間の参加者が関与するすべての手順は、人間の福祉に関する機関、国内、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査

されています

1. 収縮の測定 (SMC の例)

1. 96w10e ECIS アレイを準備します (拡大電極と電極上にシードされたセルを備えたアレイの代表的な画像については、図 1A を参照してください).
   注:滅菌組織培養層流フードの下で次の手順を実行します。
   1. 滅菌済みの96w10eアレイに、ウェルあたり200 μLの10 mM L-システインを室温で30分間コーティングします。
   2. プレートを滅菌水で2回洗います。蓋を少し開けた状態で、プレートを組織培養フードで一晩乾かします。
      注:プレートをL-システインでコーティングする必要があるのは、プレートを初めて使用するときだけです。
   3. 翌日、プレートとフタを30分間UV滅菌し、フタを上に回して内部を滅菌します。プレートが滅菌されたら、フローフードの外側でプレートを開かないでください。
2. ECIS アレイでのセルのシード
   1. 1%滅菌ゼラチン溶液をウォーターバスで30分間予温します
      注:溶液は冷蔵庫に保管されているため、固まる可能性があり、ピペットで挟むのが難しくなります。
   2. その後、ウェルごとに100 μLの1 %ゼラチン溶液でウェルをコーティングし、プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベー
   トします。
   3. ウェルからゼラチンを吸引します。
   4. 自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、200 μLのSMC培地に30,000細胞/ウェルの播種密度でSMCを三重に播種します。
   5. SMCの入ったプレートを細胞培養インキュベーターのECIS 96ウェルホルダーに入れます。 ECIS Applied Biophysicsソフトウェアをダブルクリックしてプログラムを開き、セットアップボタンを押します。
   6. すべての電極が、ウェル構成とラベル付けされた左下パネルのホルダー(緑、接続されていない場合は赤)と接触しているかどうかを確認します。電極が正しく接続されていない場合は、測定を開始する前にホルダーのプレートを調整してください。
   7. 同じパネルでプレートタイプ(96ウェルアレイ)を選択するには、[Array type]をクリックします。
   8. 右上のパネルで[Data Collection Setup]をクリックし、[Single Frequency]をクリックし、インピーダンス値を4000 Hzに、間隔を8秒に変更します。
   9. 「開始」ボタンをクリックして、測定を開始します。新しいパネルが開き、ECIS ファイルを保存できるのを待ちます。
   10. 細胞が付着し、48 h.
       注:電極上の細胞の付着と拡散により、ベースライン抵抗値が生成されます(図1B)。
3. 細胞を刺激して収縮を誘導する
   1. 10 μg/mL のカルシウム イオノフォア、イオノマイシン
      で細胞を刺激することにより、SMC 収縮を誘導します。 注:イオノマイシンは細胞外Ca²⁺の流入を誘導し、収縮性カスケードを活性化します。非刺激および刺激された収縮細胞の代表的な画像については、図2Aを参照されたい。
   2. イオノマイシン粉末1 mgをジメチルスルホキシド100 μLで希釈して10 mg/mLのストック溶液を調製し、10 μLアリコートを-20°Cで保存します。使用前に、イオノマイシン溶液をSMC培地で1:10に希釈して、細胞に添加する作業溶液を調製します。
   3. アレイが細胞培養インキュベーター内のアレイホルダーに留まり、電極がシステムに取り付けられた状態で細胞刺激を行います。
      1. 細胞を刺激するには、蓋を外してインキュベーター内の滅菌面に置きます。2 μL と 150 μL にセットした 2 つのピペットを準備します。
      2. 刺激を開始する前に、ソフトウェアのマークを押してコメントを入れてください
         注:これにより、データを分析する際に刺激の正確なタイミングを見つけやすくなります。
      3. イオノマイシン作業溶液2μLをできるだけ早く各ウェルにピペットで入れます。すべての細胞が刺激されたら、2番目のピペットを使用してウェル内の培地を混合します.
         注:急速な影響のため、異なる細胞株や条件間でチップを交換する必要はありません。イオノマイシンは急性効果があるため、刺激して混合しながら迅速に作業します。フルプレートを刺激する場合は、一度に最大3カラムを刺激します。各刺激の後、次の刺激まで少なくとも30分待って、インキュベーターのドアの開口部によって引き起こされる温度とCO₂の変化から細胞が回復するのを待ちます。
      4. 刺激が完了した直後に、もう一度 [マーク] を押して、刺激が完了したことを示すコメントを追加します。
4. 刺激実験を終える
   1. イオノマイシン刺激後約5分間のインピーダンス値を記録します。[完了]を押して録音を終了します。

結果

図1:ECISプレートのセットアップと大動脈SMC収縮のグラフィック表現。(A)左;96ウェルECISプレート。中央;ECISプレートの1つのウェルの拡大図で、ウェルの底部にある10個の電極を示しています。右;ECISプレートに播種されたSMCの光学顕微鏡画像。倍率 10x. (B) コントロールSMCをトリプリケートで播種した後にECISによって測定された抵抗曲線。太い青い線は三重の平均を表し、点線は三重の平均を表します。播種後の最初の4〜5時間で、SMCは表面全体に広がり、高抵抗(~1000 Ω)が測定されます。安定したSMC単分子膜が形成されると、抵抗は時間の経過とともに約500 Ωに減少します。略語:ECIS = electric cell-substrate impedance sensing;SMC = 平滑筋細胞;...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルアレイ	応用生物物理学	96W10IDF ペット	ECIS セットアップで収縮を測定するために使用される配列
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (旧称 ''Medium 231'')	ギブコ	M231500	平滑筋細胞の培養に使用される培地
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	472301	イオノマイシンを希釈するために使用される溶液
インビトゲン伯爵夫人 II	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AMQAX1000	自動セルカウンター
Streptomyces conglobatus由来のイオノマイシンカルシウム塩	シグマ・アルドリッチ	I0634-1MG	収縮刺激に使用される化合物
Zテタ	応用生物物理学	Zテタ	収縮測定に使用されるECIS機器