Gliding Actin Filament Assay:固定化ミオシン上のアクチンフィラメントの転座を研究するためのIn Vitro運動性アッセイ

要約

出典:Tripathi, A., et al.in vitro蛍光顕微鏡法に基づく運動性アッセイのミオシン特異的適応。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、アクチン-ミオシン相互作用を解析するためのin vitro運動アッセイを行っています。固定化されたミオシン分子上のアクチンフィラメントの滑走運動は、蛍光顕微鏡を用いて可視化されます。

プロトコル

1. グライディングアクチンフィラメントアッセイ

1. カバースリップの準備
   1. 酢酸アミルに1%ニトロセルロース溶液を作ります。
   2. ティッシュ培養ディッシュ(150×25mm)を用意し、ディッシュの底に円形の濾紙(直径125mm)を加えます。
   3. 厚さ1.5号の22mm角カバースリップ8枚をラックにセットし、約2〜5mLの200プルーフエタノールと続いて2〜5mLの蒸留水(dH₂O)で洗浄します。この洗浄ステップを繰り返し、水で終了します。次に、フィルター付きエアラインまたはN₂ラインを使用してカバースリップを完全に乾かします。
   4. カバースリップを1枚取り、1%ニトロセルロース溶液10 μLをスリップの片方の端に沿ってゆっくりとピペットで移します。次に、滑らかな動きで、滑らかな裏面の200 μLピペットチップの側面を使用して、カバースリップの残りの部分に塗りつけます。このカバースリップをニトロセルロース面を上にして、組織培養皿に置きます。残りのカバースリップについても繰り返し、残りの試薬を調製しながら乾燥させ、コーティング後24時間以内にカバースリップを使用してください。
2. チャンバーの準備
   1. 顕微鏡スライドを光学レンズペーパーで拭いて、大きな破片を取り除きます。長さ約2cmの両面テープを2枚カットします。
   2. 顕微鏡スライドの長辺の中央に沿って1枚を置きます。テープの端がスライドの端と揃っていることを確認します。2 枚目のテープを 1 枚目のテープの約 2 mm 下に置き、2 枚が平行で整列するようにします。これにより、約10μLの溶液を保持できるフローチャンバーが作成されます (図1を参照)。
   3. パート1のニトロセルロースコーティングされたカバースリップの1つを取ります。ニトロセルロースでコーティングされた面がテープに直接接触するように、カバースリップをテープに慎重に貼り付けます(図1を参照)。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェースを静かに押し下げ、カバーガラスがスライドに適切に接着されていることを確認します。スライドの端にぶら下がっている余分なテープをかみそりの刃で切ります。
3. アクチン調製
   1. 重合バッファー(50 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM DTT、25 mM MOPS(pH 7.0))で球状アクチン(G-アクチン)を重合し、4°Cで一晩かけて、20 μM F-アクチンを作製します。
   2. F-アクチンを運動バッファー(20 mM MOPS、5 mM MgCl₂、0.1 mM EGTA、1 mM DTT(pH 7.4))で5 μMに希釈します。少なくとも1.2倍モル過剰のロダミン-ファロイジンで標識します。(アルミホイルで覆われた)氷の上に少なくとも2時間放置します。これは最大1〜2か月間使用でき、氷上で保存できます。
4. ミオシン5a滑走アクチンフィラメントアッセイの実施
   注:このセクションでは、ミオシン5a(HMM)滑走アッセイの詳細を提供します。
   1. 表1に記載されているミオシン5aの溶液を調製し、氷上に保ちます。
   2. 10 μL のミオシン 5a (50-100 nM) をフローチャンバーに流し、1 分間待ちます。
   3. 1 mg/mL BSA 10 μL を 50 mM MB に 1 mM DTT (「低塩分」バッファー) で流します。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分間待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの角を使用して、紙の角をフローチャンバー出口にそっと置くことにより、溶液をチャネルに吸い上げます。
   4. 10 μL の 50 mM MB と 1 mM DTT で洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返します。
   5. 10 μL のブラックアクチン溶液 (5 μM F-アクチン、1 μM カルモジュリン、1 mM ATP、50 mM MB と 1 mM DTT) を流して、「デッドヘッド」を排除します。
      1. 1 mLのシリンジと27 Gの針で溶液をピペットで動かし、アクチンフィラメントをせん断してから、溶液をチャンバーに導入します。この手順をさらに 2 回繰り返し、3 回目から 1 分間待ちます。約 20 回のピペッティングイベントで十分です。
      2. 「デッドヘッド」スピンを行うには、塩濃度500 mMの1 mM ATPおよび1 mM MgCl₂の存在下で、化学量論的な量のF-アクチンをミオシンに添加します。次に、480,000 x gで4°Cで15分間超遠心分離します。死んだミオシンはペレットの中にあります。
   6. 50 μL の 50 mM MB に 1 mM DTT および 1 mM ATP を流し込み、チャンバー内の遊離アクチンフィラメントを枯渇させます。
   7. 10 μL の 50 mM MB と 1 mM DTT で洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返して、ATPのチャンバーを空にします。
   8. 50 mM MB中に1 mM DTTを含む20 nMローダミンアクチン(Rh-Actin)溶液を10 μL中に流し、1分間待って、アクチンフィラメントがカバースリップの表面に付着したミオシン5aに固く結合します。
   9. 10 μLの50 mM MBと1 mM DTTで洗浄し、表面に結合していないRh-Actinフィラメントを洗い流します。この洗浄をさらに2回繰り返します。
   10. 30 μL の最終バッファーに流します。
   11. 蛍光顕微鏡で励起波長561nmを用いて画像を記録し、Rh-アクチンを可視化します。適切な露光時間は、1.4 mWのレーザー出力で200 msで、合計取得時間は0.5〜1分です
       注意: 取得速度が移動するフィラメントの速度に適切にスケーリングされていることを確認してください。トラッキングプログラムで使用するデータを収集する前に考慮すべき重要なことは、取得フレームレートです。フレーム間のサブピクセル移動は速度の過大評価をもたらし、正確な値を得るためには数百ナノメートルの動きが必要です。最適な取得レートは、フレーム間の少なくとも1ピクセルの距離でアクチングライディングを行うことを特徴としています。ここでのイメージングに使用されたTIRF顕微鏡の場合、この閾値は130nmに変換されます。したがって、1 μm/sで移動すると予想されるミオシンは、200 nmの移動を達成するために5 frame/s(0.2 s間隔)の速度でイメージングする必要がありますが、10 nm/sで移動すると予想されるミオシンは0.05 frame/s(20 s間隔)を必要とします。したがって、必要に応じて、この段階でデータをダウンサンプリングできます。

>表1:滑走アッセイで使用されるバッファー

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バッファ名	構図 (M5a)	組成物(NM2b)	使用ステップ(M5a / NM2b)	コメント
4X Motility Buffer (4X MB)	80 mM MOPS、pH 7.2	80 mM MOPS、pH 7.2		真空フィルターと4°Cで保存
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0.4 mM エグタ	0.4 mM エグタ
	pH 7.4	pH 7.4
>50 mM 塩運動バッファ (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		真空フィルターをかけて4°Cで保存します
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	dH2Oでボリュームアップ	dH2Oでボリュームアップ
>500 mM 塩運動バッファ (500 mM MB)	該当なし	25% v/v 4X MB		真空フィルターをかけて4°Cで保存します
		500 mM NaCl
		dH2Oでボリュームアップ
ミオシン	0.05-0.1 μM ミオシン	0.2 μM ミオシン	4.2	氷の上に置いてください。
	1 mM DTT	1 mM DTT
	50 mM MBで希釈	500 mM MBで希釈
1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)	1 mg / mL BSAの	1 mg / mL BSAの	4.3	氷の上に置いてください。
	50 mM MBで希釈	500 mM MBで希釈
	1 mM DTT	1 mM DTT
5 μM 50 mM MB の非標識 F-アクチン (黒色アクチン)	5 μM 非標識 F-アクチン	5 μM 非標識 F-アクチン	4.5	氷の上に置いてください。ピペッティングを5〜10回上下するか、シリンジを使用してアクチンをせん断します。
	1 μM カルモジュリン (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0.2 mM CaCl2
	50 mM MBで希釈	1 μM CaM
		1–10 nM ミオシン軽鎖キナーゼ (MLCK)
		50 mM MBで希釈
MB (1 mM DTT および 1 mM ATP	1 mM DTT	1 mM DTT	4.6	氷の上に置いてください。
	1 mM ATP	1 mM ATP
	50 mM MBで希釈	50 mM MBで希釈
MB (DTT付き	1 mM DTT	1 mM DTT	4.4、4.7、4.9	氷の上に置いてください。
	50 mM MBで希釈	50 mM MBで希釈
20 nM Rhodamine-Phalloidin F-actin (rh-actin)	20 nM ローダミン-ファロイジン F-アクチン	20 nM ローダミン-ファロイジン F-アクチン	4.8	氷の上に置いてください。渦巻きにしないでください。
	1 mM DTT	1 mM DTT
	50 mM MBで希釈	50 mM MBで希釈
最終バッファ	50 mM KCl	0.7%メチルセルロース(オプション)	4.10	実験を行う直前に、ブドウ糖、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼを加えます。氷の上を保ってください。
	20 mM MOPS、pH 7.2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS、pH 7.2
	0.1 mM エグタ	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0.1 mM エグタ
	50 mM DTT	1 mM ATP
	1 μMカルモジュリン	50 mM DTT
	2.5 mg / mLグルコース	1–10 nM MLCK
	100 μg/mL グルコースオキシダーゼ	0.2 mM CaCl2
	40 μg/mLカタラーゼ	1 μMカルモジュリン
		2.5 mg / mLグルコース
		100 μg/mL グルコースオキシダーゼ
		40 μg/mLカタラーゼ

結果

図1:官能基化フローセルチャンバーの調製。(A)まず、洗浄した顕微鏡スライド、約2cmにカットした両面テープ2枚、機能化されたカバースリップから始めます。(B)顕微鏡スライドの中央にテープを追加します。(C)コーティング(つまり、ニトロセルロース)を下に向けてカバースリップをテープに取り付け、プラスチック製のピペットチップを使用してテープの重なり合う領域をそっと押して、カバースリップがチャンバーに付着していることを確認します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸アミル	ラッドリサーチインダストリーズ	10825
ATPの	ミリポアシグマ	A7699 さん
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	5470
カルモジュリン		PMID:2985564
カタラーゼ	ミリポアシグマ	C40
サーキュラーフィルターペーパー - グライディングアッセイ	ミリポアシグマ	WHA1001125
カバースリップラック	ミリポアシグマ	Z688568-1EA
カバースリップ:滑空作用型フィラメントアッセイ	VWRインターナショナル	48366-227
DL-ジチオスレイトール	ミリポアシグマ	D0632
両面テープ	オフィスデポ	909955
エグタ	ミリポアシグマ	E4378
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A4094 (英語)
G-アクチン		PMID:4254541	G-アクチンストックは、液体N2中に200μMで保存することができます。
グルコース	ミリポアシグマ	G8270
グルコースオキシダーゼ	ミリポアシグマ	G2133
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	P217-500
ラージオリフィスピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-134
メチルセルロース	ミリポアシグマ	M0512
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-553-10
モップ	フィッシャーサイエンティフィック	BP308-100
ニトロセルロース	ラッドリサーチインダストリーズ	10800
カミソリブレード	オフィスデポ	397492
ローダミン-ファロイジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R415	ストックは、100%メタノールで最終濃度200μMまで希釈できます。
組織培養ディッシュ - Gliding Assay	コーニング	353025	各組織培養皿には、約9枚のカバースリップを収納できます。
スムースサイド200μLピペットチップ	トーマス・サイエンティフィック	1158ユーランド38
備品
遠心機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75006590
顕微鏡	ニコン	モデル:100x TIRF対物レンズを備えたH-TIRFシステムを備えたEclipse Ti(NA 1.49)
顕微鏡カメラ	アンドール	モデル:iXon DU888 EMCCDカメラ(1024 x 1024センサーフォーマット)
顕微鏡環境制御ボックス	東海HIT	カスタムサーモボックス
顕微鏡レーザーユニット	ニコン	LU-n4 405nm、488nm、561nm、640nm用の固体レーザーを搭載した4レーザーユニット
Optima Max-XP 卓上型超遠心分離機	ベックマン・コールター	393315

名 の の (代表) の