Inverted Motility Assay:固定化されたアクチンフィラメント上のミオシンの動きを可視化するためのIn Vitro技術

要約

出典:Tripathi, A., et al.in vitro蛍光顕微鏡法に基づく運動性アッセイのミオシン特異的適応。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、アクチン-ミオシン相互作用を解析するためのin vitro運動アッセイを行っています。固定化されたミオシン分子上のアクチンフィラメントの滑走運動は、蛍光顕微鏡を用いて可視化されます。

プロトコル

1. タンパク質の精製

1. 細胞溶解とタンパク質抽出
   1. 表1に基づいて1.5倍抽出バッファーを調製します。ろ過して4°Cで保存します。
   2. 氷上で細胞ペレットの解凍を開始します。ペレットを解凍している間に、100 mLの抽出バッファーに1.2 mMジチオスレイトール(DTT)、5 μg/mLロイペプチン、0.5 μMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、および2つのプロテアーゼ阻害剤錠剤を補給します。氷の上を保ってください。
   3. ペレットが解凍したら、細胞培養10 mLあたり1 mLのExtraction Bufferを添加します。例えば、細胞ペレットが500 mLの細胞培養物から形成された場合、50 mLの添加抽出バッファーをペレットに加えます。
   4. 細胞ペレットを氷の上に置いたまま超音波処理します。各ペレットについて、次の条件を使用します:5秒オン、5秒オフ、持続時間5分、電力4-5。
   5. ホモジナイズしたすべての溶解物をビーカーに集め、ATP(0.1 Mストック溶液、pH 7.0)を添加して、ATPの最終濃度が1 mMになるようにします。冷たい部屋で15分間攪拌します。ATPはアクチンから活性型ミオシンを解離させ、次の遠心分離ステップで分離できるようにします。したがって、ATPの枯渇とアクチンへの再結合の可能性を最小限に抑えるために、すぐに次のステップに進むことが不可欠です。
   6. ライセートを48,000 x gで4°Cで1時間遠心分離します。これが起こっている間、製造元の指示に従って、100 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、1 Lの細胞から形成されたペレット用の50%スラリーの1〜5 mLの洗浄を開始します。.例えば、5 mLのレジンの場合、50%スラリーを10 mL洗浄します。最終洗浄ステップでは、50%のスラリーを生成するのに十分な容量のPBS1〜5 mLでレジンを再懸濁します。
   7. ライセート遠心分離後、上清を洗浄した樹脂スラリーと混合し、冷蔵室で1〜4時間静かに振とうします。待っている間に、表 1 で説明されているバッファーを作成し、氷の上に置いておきます。
2. FLAGアフィニティー精製調製
   1. ステップ1.7の溶液を500 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。樹脂はチューブの底に詰められます。レジンを乱さないように、上澄み液を取り除
   いてください。
   2. 表1に詳述されているように、レジンを50 mLのバッファーAに再懸濁し、500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。レジンを乱さないように、上澄み液を取り除
   いてください。
   3. 表1に詳述されているように、レジンを50 mLのバッファーBに再懸濁し、500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。この手順をもう一度繰り返して、レジンを20 mLのバッファーBに再懸濁します。その後、樹脂とバッファーを手で約10回チューブを静かに反転させることで、樹脂とバッファーを完全に混合します。
3. タンパク質の溶出と濃縮
   1. 表1の説明に従って30 mLの溶出バッファーを調製し、氷上で冷やします。
   2. 溶出カラムを冷蔵室に設置します。樹脂スラリーをカラムに静かに注ぎます。レジンが底部に詰まっている間、1〜2カラム容量のバッファーBでカラムを洗浄し、レジンが乾かないようにします。
   3. 1 mLのElution Bufferをレジンに流し、フロースルーを1.5 mLチューブに集めます。1 mLのフラクションを12個集めるように繰り返します。
   4. この時点で、フラクションに対して粗いブラッドフォードテストを実行して、どのフラクションが最も集中しているかを定性的に判断します。96ウェルプレートの1列に、60 μL 1x Bradford試薬をピペットで取り付けます。フラクションが収集されたら、ウェルごとに各フラクションを20 μL混合します。濃い青色は、より集中した分画を示します。
   5. 50 mLのチューブで、残りのElution Bufferをカラムに穏やかにピペッティングして残りのタンパク質を回収し、レジンに結合した残りのミオシンをカラムフロースルーで遊離させます。このフロースルーは、次のステップで集中します。その後、レジンが再利用のために再生され、製造元の指示に従って保管されていることを確認してください。
   6. 最も濃縮された3つのフラクションをプールし、100,000 MWCOの濃縮チューブを使用して、フロースルーを50 mLチューブにさらに濃縮し、残りの1 mLフラクションを濃縮します。プールしたサンプルを濃縮チューブにロードし、750 x gで4°Cで15分間遠心分離し、溶出したすべてのタンパク質が最終容量約0.5〜1 mLまで濃縮されるまで繰り返します< br /> 手記：この細孔サイズにより、分子量のカットオフ数倍の質量を持つミオシン分子の保持が可能になります。この時間経過の濃縮期間中、軽鎖はモータードメインにしっかりと結合したままであることは、最終製品に対してSDS-PAGEゲル電気泳動を行うことで確認されます。
4. 透析と瞬間凍結
   1. 表1に記載されているように、2 Lの透析バッファーを調製します。サンプルを透析バッグまたはチャンバーにロードし、冷蔵室で一晩透析します.
      手記：M5a-HMMの場合、一晩の透析後、タンパク質はその後のアッセイで使用するのに十分な純度になります。必要に応じて、ゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーなどのさらなる精製ステップを実行できます。
5. 透析後のミオシンの回復
   1. M5a-HMMの場合、透析チャンバーから全サンプルを慎重に収集し、不要な凝集体が存在する場合に備えて、4°Cで49,000 x gで15分間遠心分離します。上澄みを取ってみよう。
6. 濃度測定と瞬間凍結
   1. 製品の濃度を測定するには、分光光度計を使用して波長260、280、290、および320nmで吸光度を測定します。式 1 を使用して、濃度を mg/mL(c_mg/mL)で計算します。ここで、A_{280 は 280} nm での吸収、A₃₂₀ は 320 nm での吸収を表します。得られた濃度(mg/mL)は、式2でミオシン分子のμMに変換でき、Mはタンパク質全体(重鎖、軽鎖、蛍光色素、およびすべてのタグを含む)の分子量です
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM分子 = 1000_{c mg/mL}/M (2)
      手記：希釈が必要な場合は、高イオン強度のバッファーで行う必要があります。吸光係数(ε)は、タンパク質のアミノ酸配列をExPASyなどのプログラムにインポートすることで決定できます。M5a-HMMの典型的な収量は、約0.5〜1 mLの1〜5 mg / mLタンパク質です。本論文で用いたM5a-HMMの吸光係数は0.671であった。
   2. 精製したミオシンは、2つの方法のいずれかで保存します。重合連鎖反応チューブなどの薄肉チューブに10〜20μLを分注し、チューブを液体窒素の容器に滴下して瞬間凍結します。あるいは、20〜25μLのミオシンを直接液体窒素にピペットで入れ、凍結したタンパク質ビーズを滅菌済みの極低温チューブに保存します。いずれの場合も、得られたチューブは、将来の使用のために-80°Cまたは液体窒素で保存できます
      手記：以下に記載する運動性アッセイは、非常に少量のタンパク質を必要とするため、記載されているように、少量のアリコートでの保存は経済的です。

2. 1分子TIRFアッセイ

1. カバースリップの準備
   1. ストックパウダーを10 mgアリコート(1.5 mLチューブ内)のメトキシ-ペグ-シラン(mPEG)と10 mgアリコートのビオチン-ペグ-シラン(bPEG)に分けます。.-20°Cで密閉された湿気のない容器に保管し、6か月以内に使用してください。
   2. No.1.5H(高精度)厚さ22mm角のカバースリップ8枚をラックにセットし、2〜5mLの200プルーフエタノールと2〜5mLの蒸留水で洗浄します。この洗浄ステップを繰り返し、水で終了します。次に、エアラインまたは_N2を使用してカバーガラスを完全に乾燥させ、アルゴンで3分間プラズマクリーンします。
   3. 清潔なカバースリップを濾紙(90 mm)に載せ、組織培養皿(100 x 20 mm)に置き、70°Cのオーブンで以下の手順を実行しながらインキュベートします
      注:プラズマ洗浄は、他の化学洗浄方法に置き換えることができます。
   4. dH₂Oを含む80%エタノール溶液を調製し、HClを使用してpHを2.0に調整します。これを10 mgアリコートのmPEGに1 mL、10 mgアリコートのbPEGに1 mLを加えます。.渦を溶かし、30秒以上かからないはずです。
   5. bPEG溶液100μLを取り込み、80%エタノール(pH 2.0)900μLを加えます。この溶液は 1 mg/mL bPEG です。次に、次のように両方のPEGの溶液を作り、十分に混合します。
      1. 200 μL の 10 mg/mL mPEG (最終濃度: 2 mg/mL)。
      2. 1 mg/mL bPEG 10 μL (最終濃度: 10 μg/mL)。
      3. 80%エタノール(pH 2.0)溶液790μL。
   6. カバースリップをオーブンから取り出します。100 μLのPEG溶液を各カバースリップの中央に慎重に分注し、上面のみが濡れていることを確認します。次に、スリップをオーブンに戻し、20〜30分間インキュベー
   トします。
   7. カバースリップが穴だらけの外観になり始め、表面全体に小さな円が見えるようになったら、オーブンから取り出します。
   8. 各カバースリップを100%エタノールで洗い、エアラインで乾かし、オーブンに戻します。ステップ2でチャンバーを作成するのに必要な時間だけインキュベートします。
2. チャンバーの準備
   1. チャンバーの作成に使用する顕微鏡スライドを清掃します。長さ約2cmの両面テープを2枚カットします。
   2. 顕微鏡スライドの長辺の中央に沿って1枚を置きます。テープの端がスライドの端と揃っていることを確認します。2 枚目のテープを 1 枚目のテープの約 2 mm 下に置き、2 枚が平行で整列
   するようにします。
   3. オーブンから機能化されたカバースリップの1つを取ります(2.1で作成)。図1に示すように、PEGでコーティングされた面が下を向いてテープに直接接触するように、カバースリップをテープに慎重に貼り付けます。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェースを静かに押し下げ、カバーガラスがスライドに適切に接着されていることを確認します。
   4. スライドにぶら下がっている余分なテープをカミソリの刃で切ります。これらのチャンバーは、すぐに使用することも、ペアで50 mLチューブに入れて-80°Cの冷凍庫に保管して使用することもできます。すぐに保管しないと表面が劣化します。
3. ミオシン5a TIRF顕微鏡アッセイの実施
   1. 表2に記載されているミオシン5a倒立運動アッセイ用の溶液を調製し、氷上に保ちます。
   2. チャンバーを 10 μL の 50 mM MB と 1 mM DTT で洗浄します。
   3. 1 mg/mL BSA の 10 μL を 50 mM MB 中に 1 mM DTT で流します。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分間待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの角を使用して、溶液をチャネルに吸い上げます。
   4. 10 μL の 50 mM MB と 1 mM DTT で洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返します。
   5. 10 μL の NeutrAvidin 溶液を 50 mM MB に 1 mM DTT で流し込み、1 分間待ちます。
   6. 10 μL の 50 mM MB と 1 mM DTT で洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返します。
   7. 1 mM DTTを含むビオチン化ローダミンアクチン(bRh-Actin)を50 mM MB中に10 μL流し込み、1分間待ちます。このステップでは、大口径のピペットチップを使用し、蛍光アクチンフィラメントのせん断を最小限に抑えるためにピペッティングを上下に行わないようにして、長いアクチンフィラメントが表面(20〜30μm以上)に付着できるようにします。効果的な代替手段は、標準的なピペットチップ(開口部≈1〜1.5mm)のコーンを切断することです。
   8. 10 μL の 50 mM MB と 1 mM DTT で洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返します。
   9. 10 nM ミオシン 5a を添加した 30 μL の最終バッファーに流し込み、すぐに TIRF 顕微鏡にロードして、TIRF イメージングモダリティの最適な焦点を見つけた後で記録します。アクチンおよびGFP標識ミオシンのレーザー出力1.4 mWで、100〜200 msの露光時間が適切です。速度解析の適切な取得時間は3分です。

>表1:タンパク質精製に使用されるバッファー。

バッファ名	組成	使用したステップ	コメント
M5a 抽出バッファー	0.3 M NaCl	1.1	氷の上に置いてください。
	15 mM MOPS、pH 7.2
	15 mM MgCl2
	1.5 mM エグタ
	4.5 mM NaN3
バッファA	0.5 M NaCl	2.2	氷の上に置いてください。
	10 mM MOPS、pH 7.2
	0.1 mM エグタ
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM DTT
	5 mM MgCl2
バッファB	0.5 M NaCl	2.3	氷の上に置いてください。
	10 mM MOPS、pH 7.2
	0.1 mM エグタ
	3 mM NaN3
	1 mM DTT
溶出バッファ	0.5 M NaCl	3.1	氷の上に置いてください。
	0.5 mg/mL FLAGペプチド
	10 mM MOPS、pH 7.2
	0.1 mM エグタ
	3 mM NaN3
	pH 7.2
M5a透析バッファ	500 mM KCl	4.1	冷たいdH2Oを使用して音量を上げます。
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS、pH 7.2
	0.1 mM エグタ
	1 mM DTT

表2:TIRFアッセイで使用されるバッファー。

)

バッファ名	組成	使用したステップ	コメント
4X Motility Buffer (4X MB)	80 mM MOPS、pH 7.2		真空フィルターと4°Cで保存
	20 mM MgCl2
	0.4 mM エグタ
	pH 7.4
50 mM 塩運動バッファ (50 mM MB)	25% v/v 4X MB		真空フィルターをかけて4°Cで保存します
	50 mM KCl
	dH2Oでボリュームを上げる
150 mM 塩運動バッファー (150 mM MB)			真空フィルターで4°Cで保存
ミオシン		「最終バッファー」レシピを参照してください	氷の上を保ってください。
2 mg/mL ニュートラアビジン	2 mg / mLニュートラアビジン	3.5	氷の上に置いてください。
	1 mM DTT
	50 mM MBで希釈
1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)	1 mg / mL BSAの	3.3	氷の上に置いてください。
	1 mM DTT
	50 mM MBで希釈
200 nM rhodamine-phalloidin ビオチン化 F-アクチン (bRh-Actin)	200 nM ローダミン-ファロイジンビオチン化 F-アクチン	3.7	ボルテックスやピペッティングを上下させないため、せん断を避けてください。混ぜるには、静かに反転させます。
	1 mM DTT
	50 mM MBで希釈
MB (DTT付き	50 mM DTT	3.2、3.4、3.6、3.8	氷の上に置いてください。
	50 mM MBで希釈
最終バッファ	50 mM KCl	3.9	実験を行う直前に、ブドウ糖、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼを加えます。氷の上を保ってください。
	20 mM MOPS、pH 7.2
	5 mM MgCl2
	0.1 mM エグタ
	1 mM ATP
	50 mM DTT
	1 μMカルモジュリン
	2.5 mg / mLグルコース
	100 μg/mL グルコースオキシダーゼ
	40 μg/mLカタラーゼ
	10 nM ミオシン

結果

図1:官能基化フローセルチャンバーの調製。(A)まず、洗浄した顕微鏡スライド、約2cmにカットした両面テープ2枚、機能化されたカバースリップから始めます。(B)顕微鏡スライドの中央にテープを追加します。(C)コーティングを下に向けてカバースリップをテープに取り付け、プラスチック製のピペットチップを使用してテープと重なった領域をそっと押して、カバースリップがチャンバーに付着していることを確認します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 M MgCl2溶液	VWRの	10128-298
5 M NaCl溶液	KDメディカル	RGE-3270
酢酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	984303
アンチフラッグM2アフィニティジェル	ミリポアシグマ	A2220(英語	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPの	ミリポアシグマ	A7699 さん
ビオチン化G-アクチン	サイトスケルトン株式会社	AB07
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	5470
bPEG-シラン	レイサンバイオ株式会社	ビオチン-PEG-SIL-3400-1g
ブラッドフォード試薬コンセントレート	バイオ・ラッド	5000006
カルモジュリン		PMID:2985564
カタラーゼ	ミリポアシグマ	C40
SF-900 II SFMの細胞株(Sf9)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
サーキュラーフィルターペーパー - インバーテッドアッセイ	ミリポアシグマ	WHA1001090
EDTAフリーの完全プロテアーゼ阻害剤錠剤	ミリポアシグマ	5056489001	これは4°Cで保存する必要があります。錠剤は直接使用することも、1錠を2mLの蒸留水に溶解して25倍ストック溶液として再構成することもできます。得られた溶液は、4°Cで1〜2週間、または-20°Cで少なくとも12週間保存できます。
濃縮チューブ(100,000 MWCO)	EMDミリポア株式会社	UFC910024	チューブのMWCOは、MWCOが精製されるタンパク質の総分子量よりも小さい限り、必ずしも「万能」ではありません。M5aは30,000MWCOのチューブで濃縮されました。
クーマシーブリリアントブルーR-250染料	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20278
カバースリップラック	ミリポアシグマ	Z688568-1EA
カバースリップ:Inverted Motility Assay	アゼルサイエンティフィック	ES0107052
透析チューブ(3500 Dalton MCWO)	フィッシャーサイエンティフィック	08-670-5A	透析チューブの直径はさまざまですが、MWCOは同じである必要があります。チューブは、4°Cで20%アルコール溶液に保存できます。
DL-ジチオスレイトール	ミリポアシグマ	D0632
両面テープ	オフィスデポ	909955
DYKDDDDKペプチド	ジェンスクリプト	RP10586	これは、0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN3、および 10 mM MOPS(pH 7.2)を含むバッファーに溶解して、最終濃度 50 mg/mL にすることができます。これは、300μLアリコートとして-20°Cで保存できます。
エグタ	ミリポアシグマ	E4378
溶出カラム	バイオ・ラッド	〒761-1550	これらは再利用できます。洗浄するには、カラム容量の 2 〜 3 カラムと蒸留水でカラムをすすぎます。カラムを4°Cで冷やしてからご使用ください。
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A4094 (英語)
グルコース	ミリポアシグマ	G8270
グルコースオキシダーゼ	ミリポアシグマ	G2133
グリシン緩衝液、100 mM、pH 2-2.5、1 L	サンタクルスバイオテクノロジー	SC-295018
HCl	ミリポアシグマ	320331
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	P217-500
ラージオリフィスピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-134
ロイペプチンプロテアーゼ阻害剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78435
Mark12 汚れていない標準はしご	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LC5677
メタノール	ミリポアシグマ	MX0482
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-553-10
モップ	フィッシャーサイエンティフィック	BP308-100
mPEG-シラン	レイサンバイオ株式会社	MPEG-SIL-2000-1グラム
NaN3	ミリポアシグマ	S8032
ニュートラアビジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31050
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel、15 ウェル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0323PK2
NuPAGE LDS サンプルバッファー (4X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0007
リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
PMSFの	ミリポアシグマ	78830	PMSFは、イソプロパノール中の0.1 Mストック溶液として調製し、4°Cで保存することができます。イソプロパノールを添加すると結晶沈殿が起こり、室温で攪拌することで溶解することができます。使用直前に、PMSFを急速攪拌溶液に滴下して最終濃度0.1 mMにすることができます。
カミソリブレード	オフィスデポ	397492
ローダミン-ファロイジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R415	ストックは、100%メタノールで最終濃度200μMまで希釈できます。
SF9 メディア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒12658-027	これは4°Cで保存する必要があります。その貯蔵寿命は製造日から18ヶ月です。
組織培養ディッシュ - インバーテッドアッセイ	コーニング	353003	各組織培養皿には、約4枚のカバースリップを収納できます。
スムースサイド200μLピペットチップ	トーマス・サイエンティフィック	1158ユーランド38
備品
遠心機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75006590
顕微鏡	ニコン	モデル:100x TIRF対物レンズを備えたH-TIRFシステムを備えたEclipse Ti(NA 1.49)
顕微鏡カメラ	アンドール	モデル:iXon DU888 EMCCDカメラ(1024 x 1024センサーフォーマット)
顕微鏡環境制御ボックス	東海HIT	カスタムサーモボックス
顕微鏡レーザーユニット	ニコン	LU-n4 405nm、488nm、561nm、640nm用の固体レーザーを搭載した4つのレーザーユニット
ミッドベンチ遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	モデル:CR3i
ミソニックスソニケーター	ミソニックス	XL2020 (英語
Optima Max-XP 卓上型超遠心分離機	ベックマン・コールター	393315
プラズマクリーナー	Diener electronic GmbH + Co. KG	システムタイプ:Zepto
ソニケータープローブ(3.2 mm)	Qsonicaの	4418
スタンダードインキュベーター	バインダー	モデル:56
ウェイバリーチューブミキサー	ウェイバリー	TR6E

の ) 名 の 名 の (代表) の ) 社 名