ヒト化メディエーター酵素放出アッセイ:in vitroで好塩基球脱顆粒反応をモニタリングすることにより、試験抗原のアレルギー性をスクリーニングする免疫化学的方法

要約

出典:Wenger, M. et al.アレルゲン効力の読み出しとしてのヒト化メディエーター放出アッセイ。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、好塩基球脱顆粒を誘導する抗原のアレルギー性を評価するin vitro法について説明します。β-ヘキソサミニダーゼは化学メディエーター放出の指標として使用され、β-ヘキソサミニダーゼの酵素活性は蛍光基質を使用して測定されます。

プロトコル

人間の参加者が関与するすべての手続きは、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査

されています

1. huRBL細胞の受動的感作

1. インキュベート済みのAg8/血清懸濁液を250 x gで5分間遠心分離します。
2. 遠心分離したAg8/血清懸濁液50 μLを、Ag8細胞ペレットを乱さずにhuRBL細胞を含む各ウェルに移します。
   1. 感作されているが刺激されていない(抗原を添加しない)細胞である抗原コントロールはなく、下部のシグナルプラトー/バックグラウンドの指標として機能します。バックグラウンドおよび最大溶解コントロールウェルは、血清で感作する必要はありません。代わりに、50 μL の huRBL 培地をウェルの制御に添加します。
3. プレートを蓋で覆い、37°Cおよび5%-7%CO₂で一晩インキュベートします。

2. 抗原刺激による脱顆粒とメディエーター放出

1. 1x Tyrode's buffer (9.5 g/L Tyrode's salts, 0.1% boly serum albumin (BSA), 0.5 g/L Sodium hydrogen carbonate (NaHCO₃) in dH₂O) で抗原希釈液をあらかじめ調製してください。ウェルあたり100μLの最終量が必要です.
   手記：天然由来のアレルゲンや組換えで精製されたすべてのアレルゲンが、1x Tyrodeの緩衝液中で安定しているわけではありません。したがって、アッセイ手順の前に、1x Tyrodeのバッファーで安定性試験を実施してください。あるいは、1x Tyrodeのバッファーを酸化重水素(D₂O)で希釈して、アッセイのS/N比を高めます。
2. 1:10希釈シリーズの目的の抗原を反応チューブ内で8回希釈し、10または1μg/mLのタンパク質で開始します
   注:必ず事前に希釈シリーズをテストしてください。あるいは、1:10希釈シリーズ(1:5、1:20、1:30など)を完全な放出曲線をカバーするように適合させます。さらに、開始濃度は実験のセットアップによって異なる場合があります。
3. 96ウェルプレートに播種したhuRBL細胞を洗浄するには、まずプレートを慎重に吸引し、反転させ、吸収紙に叩いて、血清含有細胞培地を取り出します。
4. ウェルあたり200 μLの1x Tyrodesバッファーで細胞を洗浄します。すべての井戸を同様に扱います.
   手記：細胞を乱さないように、洗浄液をゆっくりと細胞に加えます。
5. 約30秒間放置し、洗浄手順を合計3回繰り返します。
6. 洗浄液を最後に添加した後、抗原希釈液の添加を続行する準備ができるまで溶液をウェルに残します.
   手記： 細胞を長時間空気にさらさないでください。
7. 100 μLの抗原溶液を、感作済みhuRBL細胞を含む各ウェルに移します
   注:いくつかの異なるパラメータを分析する場合は、希釈シリーズの個々のサンプルを追加の非結合性96ウェルプレート(huRBLプレートと同じレイアウトを使用)に移し、その後、マルチチャンネルピペットでhuRBL細胞プレートに直接移します。これにより、細胞を長時間空気にさらすことを避けることができ、アッセイ性能が低下する(シグナルが低下する/シグナルがない)可能性があります。
8. コントロールウェル(最大溶解細胞および非感作バックグラウンド細胞)を100 μLの1x Tyrode's bufferで覆います。これらのコントロールウェルを抗原で刺激しないでください。
   1. さらに、希釈シリーズの感作性非抗原ウェルに100 μLの1x Tyrode's bufferを添加します。これは、データ解析中に感作細胞の抗原に依存しない自然放出を考慮に入れるために必要です。
9. huRBL細胞を37°Cおよび5%-7%CO₂で1時間インキュベートします。

3. β-ヘキソサミニダーゼ活性の蛍光測定

1. 最大溶解コントロールのウェルをウェルあたり10 μLの10% Triton X-100で処理し、適切に混合して細胞を完全に溶解し、β-ヘキソサミニダーゼを100%放出します。
2. 50 μLの基質溶液を新しい非結合性96ウェルプレートに加えます。96ウェルプレート1枚の基質溶液:5 mLの0.1 Mクエン酸アッセイバッファー、pH 4.5;10 mM 4-メチルウンベリフェリルN-アセチル-β-D-グルコサミニド80 μL。
3. すべてのウェルの細胞上清50μLを、基質溶液を含む新しいプレートに移します
   注:huRBL細胞を混乱させないように、上清をhuRBLプレートから慎重にピペットで取り出します。
4. プレートを基質溶液および細胞上清と共に37°Cで1時間インキュベートし、蛍光基質の変換を可能にする
   手記：細胞生存率アッセイのためにhuRBLプレートを保管してください。
5. 1ウェルあたり100 μLの停止溶液(15 g/Lグリシン、11.7 g/L NaClをdH₂Oに溶解、pH 10.7)を加えます。
6. プレートリーダーを使用して、360 nmの励起と465 nmの発光で蛍光を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-メチルウンベリフェリル N-アセチル-β-D-グルコサミニド	シグマ	M2133
huRBL細胞用96ウェルプレート(Nunc MicroWell 96-Well、Nunclon Deltatreated、平底マイクロプレート)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	167008
基質溶液および細胞上清用の96ウェルプレート(Greiner BioOne未処理96ウェルマイクロプレート)	フィッシャーサイエンティフィック	655101
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ	10735078001
クエン酸	アプリケム	131018
グリシン	アプリケム	A3707
塩化ナトリウム(NaCl)	アプリケム	A2942(英語版)
炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)	アプリケム	131638
トリトンX-100	シグマ	X100
タイロードの塩	シグマ	T2145