ATPベースのルシフェラーゼ生存率アッセイ:腫瘍オルガノイド上の試験剤の成長阻害能を評価するための均質な方法

要約

出典:比嘉、A.他患者由来腫瘍オルガノイドを用いたハイスループットIn Vitroアッセイ。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、細胞内ATPレベルを細胞代謝活性のマーカーとして使用して、試験剤で治療した患者由来オルガノイドの細胞生存率を評価するための迅速な単一添加アッセイを実演します。細胞内ATPレベルは、ルシフェラーゼ/ルシフェリン反応を用いて測定され、放出された光強度は細胞の生存率を示し、ひいては試験剤の増殖阻害力を示します。

プロトコル

1. Growth Inhibition High-Throughput Screening (HTS)

注: 患者由来腫瘍オルガノイド (PDO) に対する抗がん剤の増殖阻害活性は、図 1 に示すように、細胞内 ATP 含有量を測定することによって評価されます。このステップは、市販の細胞生存率アッセイキットを使用して行います(Table of Materialsを参照)。

1. 0日目に、PDO(RLUN007など)をフラスコで培養し、アッセイに十分な数の細胞クラスターが利用可能になるまで培養します。播種する1日前に、PDO懸濁液を75cm²フラスコから15mLチューブに移し、200 x gで2分間遠心分離して、PDOペレットの量を測定します。次に、PDOペレットを15 mLの新鮮な培地に再懸濁し、75 cm²フラスコに戻します。細胞を37°Cで5%CO₂で培養します。
   注: 必要なPDOペレット容量は、各PDOの希釈速度とアッセイに使用した384ウェルプレートの数によって異なります。RLUN007の場合、10枚の384ウェルプレートに播種するために200μLの細胞ペレット容量が必要です。
2. 1日目(培地交換後24時間後)に、70 μmメッシュフィルターを含むフィルターホルダーを備えた細胞断片化および分散装置(Table of Materialsを参照)を使用してPDOをミンチします。次に、PDO懸濁液15mLを10倍に希釈します。細胞懸濁液ディスペンサー(Table of Materialsを参照)を使用して、PDO懸濁液40μLを384ウェル超低付着スフェロイド(丸底)マイクロプレート(Table of Materialsを参照)に播種します。
   注: 細胞クラスターをミンチするには、市販の細胞断片化および分散装置を使用することをお勧めします (Table of Materials を参照)。
3. 播種後24時間後(2日目)に、リキッドハンドラーを使用して、最終濃度が20 μM〜1.0 nM(10段階希釈)の範囲で0.04 μLの試験剤溶液でPDOを処理します(Table of Materialsを参照)。
4. 8日目(試験物質処理の144時間後)に、細胞内ATP測定試薬を試験ウェルに加えます。ミキサーを使用してプレートを混合し、25°Cで10分間インキュベートし、プレートリーダーを使用して細胞内ATP含有量を発光として測定します(Table of Materialsを参照)。
5. 細胞生存率を計算するには、テストウェル内のATPの量を、ビヒクルを含むコントロールウェル内のATPの量で割り、バックグラウンドを差し引きます。6日間の成長率を計算するには、播種後24時間後の車両制御井のATPの量を車両制御井のATPの量で割ります。
6. 生物学的データ分析ソフトウェアを使用して、用量反応曲線から50%阻害濃度(IC₅₀)と曲線下面積(AUC)の値を計算します(Table of Materialsを参照)。Z係数は、Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|として定義される1(無限分離)から<0までの無次元パラメータであり、σc+、σc-、μc+、およびμc-は、高(c +)および低(c-)コントロールの標準偏差(σ)および平均(μ)です。 それぞれ。

結果

図1: 384ウェルマイクロプレートを使用したハイスループットアッセイシステムの作成に使用したプロトコルの要約。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
384ウェル超低接着スフェロイドマイクロプレート	Corning	4516	HTS
がん細胞増殖培地用プレート プラス	富士フイルム和光純薬	032-25745	F-PDO用培地
CellPet FT	JTEC	細胞	断片化分散装置
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683	細胞生存率発光アッセイ、細胞内ATP測定試薬
Echo 555	Labcyte-Liquid		handler
EnSpire	PerkinElmer-Plate		リーダー
Morphitソフトウェア、バージョン6.0	The Edge Software Consultancy		生物学的データ解析ソフトウェア
Multidrop Combi	ThermoFisher Scientific	5840300	細胞懸濁液ディスペンサー
RLUN007	富士フイルム和光純薬または住商ファーマシューティカルズインターナショナル		肺腫瘍由来F-PDO
超低アタッチメント75cm²フラスコ	:コーニング	3814PDO	用培養フラスコ